Phorbol 12-myristate 13-acetate  别名：PMA, TPA, 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate; 12,13-tetradecanoyl phorbol acetate; 佛波酯

Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 是一种佛波酯，是蛋白激酶C (PKC) 和 SphK 的激活剂，提高细胞内 Ca2+ 浓度 ([Ca2+]i)，EC50 为 11.7 nM，这种作用具有剂量依赖性。PMA可以诱导 THP1 细胞分化（80ng/ml，24h）。Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 也是NF-κB激活剂。

将 THP-1 细胞以 1×10⁵ cells/ml、5×10⁵ cells/ml、1×10⁶ cells/ml 和 5×10⁶ cells/ml 的密度，分别接种到 6 孔细胞培养板中，用 80 ng/ml 的 PMA 诱导。分别在 12 小时、24 小时和 36 小时收集细胞，用流式细胞术检测不同诱导时间对应的不同细胞接种密度的样品。双因素方差分析结果显示，不同细胞接种密度组间的 CD14 分子阳性率有显著差异，5×10⁵ cells/ml 组的 CD14 阳性率（41.4%±8.8%）高于其他接种密度组。不同诱导时间组间CD14阳性率差异有统计学意义，诱导时间为24h组CD14阳性率高于其他诱导时间组（36.7%±11.7%）。

中性粒细胞胞外陷阱的可视化和定量

2. 材料

2.1. 设备

1. 肝素钠涂层的 vacutainers。
2. 50 ml 锥形管。
3. 塑料 1.5 ml 巴斯德移液器。
4. 12 孔平底培养板。
5. 24 孔平底培养板。
6. 黑色平底 96 孔板。
7. 大容量离心机。
8. 离心机。
9. 组织培养罩。
10. 组织培养箱。
11. 倒置共聚焦荧光显微镜。
12. 荧光酶标仪（激发波长：~480 nm;发射波长：~520 nm）。

2.2. 试剂

1. 不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的汉克平衡盐溶液 （HBSS）。
2. 12% 葡聚糖溶液：v/v，用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS 稀释。
3. Histopaque 1077 和 1119。
4. 1.8% 盐水溶液：1.8 g NaCl 溶于 1 L 蒸馏水和无菌过滤器中。
5. OptiMEM 培养基。
6. RPMI1640 中等。
7. 胎牛血清 （FBS）。
8. 山羊血清。
9. 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。
10. 0.05% PBS-T：PBS v/v 中的 Tween-20。
11. 4% 多聚甲醛 w/v （PFA）。
12. 染色封闭液：PBS 中的 5% 山羊血清 v/v。
13. 佛波酯（PMA）作为 NET 释放的阳性对照。
14. SYTOX Green 核酸染色剂。
15. Quant-iT PicoGreen dsDNA 试剂盒。
16. 对人中性粒细胞弹性蛋白酶反应的抗体。
17. 对瓜氨酸组蛋白反应的抗体 3.
18. 对髓过氧化物酶反应的抗体。
19. 二抗溶液：封闭液中 1：500 v/v Alexa Fluor 564 标记的抗体。

3. 方法

下面描述的方法概述了 （1） 从外周血中分离人中性粒细胞的过程;（2） 中性粒细胞培养;（3） NETs 的免疫染色;（4） NETs 的光谱定量。

3.1. 从外周血中分离人中性粒细胞

1. 通过静脉穿刺将血液收集到肝素涂层的 vacutaines 中。在组织培养罩中使用无菌试剂继续执行后续步骤。
2. 将血液汇集到 50 ml 锥形管中，加入葡聚糖以形成 1.2% 溶液。例如，对于 30 ml 全血，添加 3 ml 12% 葡聚糖。
3. 轻轻倒置 5-10× 混合，并在室温下放置 20 分钟，让红细胞 （RBC） 沉淀。
4. 当红细胞沉淀时，设置15 ml锥形管，底部放置3 ml Histopaque 1119，并小心地用3 ml Histopaque 1077覆盖。如果界面准备得当，两个 Histopaque 层之间应该有一条划定清晰的线。如果没有，请丢弃并重新准备。
5. 红细胞沉淀后，应使用塑料巴斯德移液管将血浆顶层转移到组织菌层的顶部。
6. 在室温下以 450 × g 离心组织菌/血浆层 25 分钟，无需制动，以从单核细胞中分离出中性粒细胞。
7. 小心吸掉顶部的三层并丢弃，然后将中性粒细胞层收集到新的 50 ml 试管中。
8. 加入 HBSS（不含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺）至 50 ml，并在室温下以 450 × g 离心 10 分钟，并带制动器。
9. 去除 HBSS 并重悬细胞沉淀。
10. 为了去除污染的红细胞，重悬细胞沉淀，向试管中加入 25 ml 无菌蒸馏水，倒置混合，然后立即加入 25 ml 无菌 1.8% 盐水溶液以恢复张力。
11. 在室温下以 450 × g 离心 10 分钟以沉淀中性粒细胞。
12. 去除上清液，将中性粒细胞沉淀重悬于补充有 2% FBS 的 OptiMEM 培养基中。
13. 可以对细胞进行计数，通过流式细胞术检查中性粒细胞标志物（如 CD16b）的纯度，并铺板用于实验。

3.2. 中性粒细胞培养物的制备

1. 将中性粒细胞接种到无菌培养板中，用于 NET 可视化和定量实验。对于可视化实验，在 24 孔板的每孔中接种 2 × 10⁵ 个嗜中性粒细胞，对于定量，在 12 孔板的每孔中接种 1 ×10 ⁶ 个嗜中性粒细胞。
2. 将感兴趣的刺激物添加到中性粒细胞中。作为阳性对照，应向细胞中加入 50 nM PMA。
3. 在 37 °C/5% CO₂ 中培养嗜中性粒细胞，以在分析前获得最佳时间点。

3.3. NET 的免疫染色

1. 在使用前制备 167 nM SYTOX Green 溶液，方法是在 30 μl HBSS 中稀释 1 μl 染料，然后每 ml HBSS 中使用 1 μl 染料。避光存放直至准备使用。SYTOX Green 是一种细胞膜不渗透的 DNA 结合染料。
2. 在优化的处理时间点后，从培养箱中取出嗜中性粒细胞板，吸出培养基，然后用 1 ml HBSS 轻轻洗涤孔两次。
3. 在室温下在黑暗中向每个孔中轻轻加入 0.5 ml SYTOX^® Green 溶液 15 分钟。
4. 吸出染料并用 HBSS 轻轻洗涤两次。从这时起，在黑暗中进行所有孵化。
5. 在室温下在黑暗中向每个孔中轻轻加入 0.5 ml 4% PFA 10 分钟。
6. 吸出 PFA 并用 HBSS 洗涤两次。
7. 在室温下在黑暗中用 0.5 ml 封闭溶液封闭每个孔 1 小时。
8. 为每个孔准备 0.5 ml 一抗溶液（1：100 瓜氨酸组蛋白 3 或 MPO 或 NE 在封闭溶液中）。确保包括同种型匹配的 IgG 对照。
9. 在 4 °C 下孵育过夜，并用 PBS-T 洗涤两次。
10. 向每个孔中加入 0.5 ml 二抗溶液。
11. 在室温下避光孵育 1 小时。
12. 用 PBS-T 洗涤两次后，即可使用倒置共聚焦荧光显微镜观察 NET。

3.4. NET 的半定量

1. 在最佳时间点处理后收集嗜中性粒细胞条件培养基。
2. 将条件培养基在 4 °C 下以 2000 × g 离心 5 分钟，并收集上清液
3. 在制备样品时，可以解冻 Quant-iT PicoGreen 试剂盒，并根据制造商的说明使用无菌、蒸馏、无 DNase 的水制备 1 × TE 缓冲液。
4. 在提供的 100 μg/ml 噬菌体 lambda DNA 标准品解冻并充分涡旋后，可按照制造商的说明使用 TE 缓冲液在不含核酸和 DNA 酶的 Eppendorf 管中制备标准曲线。标准曲线通常范围为 1 ng/ml 至 1 μg/ml，但可以准确稀释至 25 pg/mL。
5. 在黑色平底 96 孔板中，使用 TE 缓冲液制备每种条件培养基的不同稀释度，以确定下游分析所需的最佳稀释度。根据我们的经验，在 1 ml 含 50 nM PMA 的培养基中培养 1 ×10 ⁶ 个嗜中性粒细胞 4 小时需要在分析前将条件培养基以 1：4 稀释，以使样品荧光符合标准曲线的荧光水平。（一旦确定了最佳稀释度，就可以在每个孔中稀释样品，即首先将 75 μl TE 缓冲液移液到所有孔中，然后每个样品中加入 25 μl）。
6. 标准品应一式两份分析，每个样品一式三份分析。
7. 将所有标准品和样品移液到板中后，通过在塑料容器中将提供的染料原液在 TE 缓冲液中稀释 200 倍来制备 PicoGreen 染料。这种溶液容易发生光降解，因此请在使用前准备并在黑暗中储存。
8. 彻底涡旋染料溶液，并将 10 μl 染料移液到每个孔的一侧。随着时间的推移，染料液滴会掉落并与样品混合。
9. 将染料添加到所有孔中后，通过轻轻敲击板，确保染料液滴已与每个样品混合。从这一点开始，板是光敏的，应该被覆盖。
10. 将板在室温下孵育 5 分钟，然后使用荧光读板器（激发波长：480 nm;发射波长：520 nm）读取。
11. 使用来自标准曲线的荧光水平，可以计算每种条件培养基中细胞外 DNA 的总量。