Calcein-AM/PI活死细胞双染试剂盒  别名：Calcein-AM/PI Double Staining Kit

本试剂盒内含有钙黄绿素-AM (Calcein-AM)和碘化丙啶 (PI)，Calcein AM 是在传统的Calcein上添加上乙酰甲氧基甲酯即（AM）基团，疏水性增加，能很容易穿透活细胞膜，进入细胞内。Calcein AM本身无荧光，进入细胞后被细胞中内源性酯酶水解，生成具有强负电荷且不能通过细胞膜的极性分子Calcein滞留在细胞内，而Calcein可发出强绿色荧光（Ex/Em= 494nm/517nm）。由于死细胞缺乏酯酶，不能或很少能产生Calcein，因此仅活细胞会被染色为强绿色荧光，死细胞不能被染色或者染色非常弱。PI不能透过活细胞的细胞膜，死细胞的细胞膜选择透过性丧失，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）可以进入胞内与双链DNA特异性结合并产生强烈的红色荧光（Ex/Em=535nm/617nm），从而对死细胞进行标记。因此，Calcein AM与碘化丙啶联合使用，可以对活细胞与死细胞同时进行双重荧光染色，可用于细胞活性与细胞毒性的检测。用490nm激发时可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞；而用545nm激发时仅可观察到死细胞。

产品应用效果如下所示：

Hela细胞凋亡处理后，使用2 µM calcein AM, 8 µM PI检测，孵育时间40 min。检测条件：荧光显微镜，200×。染色结果显示，活细胞细胞质成绿色荧光，死细胞细胞核呈红色荧光，颜色鲜明。

使用说明（仅供参考）

1. Calcein AM/PI检测工作液的配制:

a.按照96孔板每孔100μl Calcein AM/PI检测工作液的体系，取出Calcein-AM Solution和PI Solution，室温平衡30分钟。
b.在1ml的检测缓冲液中加入1μl的PI Solution和1μl的CalceinAM Solution，涡旋震荡混匀制成工作液。 所得到的的工作液可直接用于染色细胞。
注1：为得到比较理想的结果，可根据细胞类型和实际染色效果对Calcein AM (1000X)和PI (1000X)在500-2000稀释倍数之间 进行适当调整。
注2：配制好的Calcein AM/PI检测工作液必须一次使用完毕，不能冻存。

2. 荧光显微镜检测：

a. 接种培养。将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。
b. 洗涤(选做)。对于贴壁细胞，去除培养液，用PBS洗涤细胞2遍；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5min，吸除上清， 用PBS洗涤2遍。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，尽可能洗干净。
c. 染色。加入适当体积的检测工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入 500μl，6孔板每孔加入1ml。37ºC避光孵育30min。
d. 检测。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光， Ex/Em=535/617nm)。

3. 流式细胞仪检测：

a. 细胞准备。贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤2次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5min，弃上清，用PBS 洗涤2次。每个样品推荐的细胞用量为10⁶ 个细胞。
b. 染色。对于上一步骤的10⁶ 个细胞的沉淀，加入1ml Calcein AM/PI检测工作液，重悬为单细胞悬液。37ºC避光孵育30min。 注：需要准备好仅含缓冲液的细胞样品用作流式细胞仪检测时的阴性对照，该缓冲液与配制Calcein AM/PI检测工作液的缓冲液宜保持一致。同时准备两管额外的细胞样品，每管只加入一种染料(Calcein AM或PI)，用于流式单染的补偿调节。
c. 检测。孵育完成后，直接进行流式细胞仪检测，(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光， Ex/Em=535/617nm)。

4. 荧光酶标仪检测：

a. 按照实验要求准备对照样本，无细胞对照（G、H），活细胞对照（E、F）和死细胞对照（C、D）。死细胞对照可以按照步骤一方法制备。如果测量死活细胞的相对增量，那么对 照可以不用设置。

b. 贴壁细胞可直接检测。悬浮细胞：将染色好的细胞悬液以每孔100μl加入至微孔板各孔。【注：每孔细胞最低检测值大约为200-500个，每孔最大常用细胞测值约为106个。】

c. 使用荧光酶标仪以合适的激发和发射滤光片收集样本数据。为了获得最佳的灵敏度，所使用的酶标仪，建议采用带光学过滤器的信号激发器，可保证不互相干扰。
d. 结果分析与计算：
死细胞的特点是在645nm下有强荧光信号，而530nm处有弱荧光信号。在计算结果之前，可以分别从F(530)和F(645)的所有值中减去背景荧光读数F(530)0和F(645)0。活死细胞的百分比可以定义为荧光读数的计算：
Live Cells% =（F(517)sam- F(517)min）/（F(517)max- F(517)min）
Dead Cells% =（F(617)sam- F(617)min）/（F(617)max- F(617)min）
绝对活死细胞数量的计算：制作细胞数与荧光读数（517nm和617nm）的标准曲线，荧光强度与样本中的细胞数成线性正相关。

保存条件：

-20℃避光保存，有效期1年。

注意事项：

1. 由于Calcein-AM储存液对湿度非常敏感，请在每次使用后紧紧密封Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完，建议根据单次用量分装密封保存，防止
潮湿环境中发生自发性酯水解。例如分装成10μl/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在-20℃密封避光保存。

2. 染色前使用无血清培养基（血清中可能含有酯酶）或者 PBS 洗涤细胞，缓冲液中不能含有初级或次级胺，因为脂肪组胺可裂解 AM 酯并妨碍负载。

3. Mn2+会加速荧光淬灭，洗涤 buffer 中注意不要含有 Mn2+等金属离子。

4. 适用于任何含酯酶活性的动物细胞，植物和细菌因含有细胞壁，Calcein AM 不能进入细胞内，因此不适用于植物和细菌样本。

5. 染色工作液必须现配现用，配制好的工作液请在当天使用。

6. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用本试剂盒的过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。建议染色后尽量当天完成检测。用于荧光显微镜检测时，对于贴壁能力弱的细胞，建议先做防脱处理后再进行细胞接种和染色，且 PI染色时间不要超过 30min，否则会导致 PI 假阳性，若需要延长 Calcein AM 染色时间，可在染色结束前的 10~30min 内加入 PI，染色后 1~2h 内及时拍照。