Annexin V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

AbMole Annexin V-FITC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒用于检测细胞凋亡早期的发生，其中Annexin V为胞内蛋白膜联蛋白家族成员，以钙离子依赖的方式选择性与磷脂酰丝氨酸(PS)结合。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会把PS外翻到细胞膜外侧。用带有FITC标记的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以通过流式细胞仪或荧光显微镜检测到 PS 外翻这一细胞凋亡的重要特征。

7-氨基放线菌素D（7-AAD）是一种非浸入性染料，可以用来检测无活性的细胞。它不能通过正常质膜，随着细胞凋亡、细胞死亡过程，质膜对7-AAD的通透性逐渐增加。染料一旦进入细胞，它将结合到细胞内DNA分子上，在合适波长激发光的激发下发出明亮的红色荧光。7-AAD同PI有着相似的荧光特性，但其发射波谱较PI窄，对其他检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。

将Annexin V-FITC与7-AAD联合使用时，7-AAD被排除在活细胞（Annexin V-/7-AAD-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/7-AAD-）外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC和7-AAD结合染色呈现双阳性（Annexin V+/7-AAD+）。

FITC最大吸收波长为490nm，激发波长为525nm。7-AAD可被488 nm氩离子激光激发，发射波长为647nm。

使用步骤（仅供参考）

一、仪器参数调节
1. 收集1×10⁶-3×10⁶个细胞，用预冷PBS离心洗涤两次，弃上清。
2. 加入适量预冷1×Binding Buffer重悬，并加入数量相同且未经处理的活细胞与之混合。加入预冷1×Binding Buffer补充至1.5ml，等分成三管，其中一管为空白对照管、两管为单染管。
3. 单染管分别加入5μl Annexin V-FITC或5μl 7-AAD室温避光孵育5分钟。
4. 在流式细胞仪上，用空白管调节 FSC、SSC和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿。
注：某些将贴壁细胞处理为单个细胞的过程中会造成细胞膜损伤，从而造成Annexin V假阳性。因此需要进行优化。可使用对细胞更温和的酶如Accutase处理贴壁细胞。

二、样本检测
1. 按实验方案诱导凋亡。
2. 用预冷 PBS 离心洗涤，收集1-10×10⁵ 个细胞（包括培养上清中的细胞)。用双蒸水稀释 5× Binding Buffer为1× 工作液，取500ul 1xBinding Buffer重悬细胞。
3. 每管加入 5ul Annexin V-FITC 和 5μl 7-AAD。
4. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5分钟。
5. 一小时内上流式细胞仪测定结果。

保存条件

2-8℃避光保存，一年有效。Annexin V-FITC不可冷冻。

注意事项

1. 试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

2. Annexin V-FITC和7-AAD是光敏物质，在保存与操作时请注意避光。

3. 在细胞洗涤的最后一步，请尽量将上清弃净，以免PBS残留影响实验结果。

4. 为获得准确试验结果，建议样品在Annexin V-FITC染色后1小时内进行分析。