【AbMole科研快报】BRD9介导的染色质重塑通过负反馈机制抑制破骨细胞形成

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本期与您分享的是：BRD9介导的染色质重塑通过负反馈机制抑制破骨细胞形成。

含溴域蛋白9（BRD9）是非典型BAF染色质重塑复合物的组成部分，已被确定为血液病的关键治疗靶点。尽管破骨细胞起源于造血，但BRD9在破骨细胞形成和骨病中的作用仍未解决。本研究发现髓系Brd9缺陷通过下调干扰素-β（IFN-β）信号通路增强破骨细胞谱系的增殖和骨吸收，并抑制破骨细胞生成。

研究发现BRD9与转录因子FOXP1相互作用，随后激活Stat1转录和IFN-β信号。此外，BRD9与BRD4在破骨细胞形成过程中的功能特异性也得到了评估。利用BRD9的药理学调节和柔韧性可注射丝素水凝胶的优势，设计了一种局部给药系统，可有效缓解脂多糖诱导的局限性侵袭性牙周炎的唑来膦酸盐相关颌骨骨坏死和急性骨丢失。总之，这些结果证明了BRD9在破骨细胞生成中的功能及其对骨病的治疗潜力。

(+)-JQ1（Abmole，M2167，纯度>99%）是一种BET bromodomain抑制剂，作用于BRD4(2)，IC50为33 nM，结合到BET家族的所有Bromodomain结构域，而不结合到BET家族以外的Bromodomain结构域，JQ1通过c-MYC介导的途径下调CD47的表达。

Zoledronate（Abmole，M2329，纯度>99%）唑来膦酸，是第三代含氮二磷酸盐，具有高效的抗骨质再吸收活性。Zoledronic Acid 能抑制破骨细胞的分化和凋亡。Zoledronic Acid 也有抗癌作用。

Fig. 7 | Function specificity of BRD9 distinguished from BRD4.

PROTACs（蛋白水解-靶向嵌合体），直接蛋白质特异性降解使用双功能分子与多肽连接E3连接酶和靶蛋白配体，被报道为临床试验中各种疾病的一种有前途的治疗策略。用化学PROTAC BRD9降解剂dBRD935评估了BRD9在破骨细胞形成过程中的功能。

研究证实，dBRD9处理RANKL诱导的BMDMs中TRAP+多核分化破骨细胞的数量和大小呈剂量依赖性增加，在1 μM浓度下没有明显的细胞毒性图7a, b。选择0.3 μM dBRD9浓度进一步评价其促进破骨细胞形成的最显著作用。与使用iBRD9的结果一致，根据转录谱确定IFN-β信号通路活性是BRD9降解后的主要下调信号通路之一，并发现BRD9降解导致Mmp9、Acp5、Dcsstamp破骨基因表达增强，Stat1表达下调（图7c）。此外，上调IFN-β信号后，dBRD9治疗后增加的破骨细胞生成得以恢复，如TRAP +分化的破骨细胞数量和大小减少（图7d），以及Mmp9、Acp5和Dcstamp破骨基因表达下调（图7e）。

据报道，BRD9通过与BRD412合作调节巨噬细胞的激活。除了BRD9抑制破骨细胞形成的发现外，之前的研究表明BRD4抑制抑制了RANKL诱导的破骨细胞形成。为了区分BRD9和BRD4的功能特异性，比较了破骨细胞形成过程中BRD9降解后与dBRD9的转录谱，以及BRD4抑制与JQ1的转录谱。除破骨细胞相关基因发生明显相反的变化外（图7f），还列出了JQ1处理组较dBRD9处理组富集的前十大改变信号通路（图7g）。

我们注意到，与dBRD9治疗组相比，JQ1治疗组细胞周期和破骨细胞分化过程是最主要的改变途径。JQ1处理组细胞周期相关特征基因明显下调（图7h），提示其可能在破骨细胞形成过程中导致dBRD9与JQ1作用相反，具体机理有待进一步研究。

Fig. 8 | BRD9 degrader mitigates ZOL-related ONJ after tooth extraction.

与ZOL相关的颌骨的骨坏死（ONJ）与拔牙后患者的破骨细胞生成受损有关，长期服用强抗骨吸收剂此外，最近的研究也揭示了ONJ的发病机制也与巨噬细胞过度活化和炎症过程有关。而目前尚无预防或有效治疗ONJ的方法。鉴于化学制剂PROTAC dBRD9在滑膜肉瘤和白血病的临床前模型中显示的疗效，我们推测，以促破骨细胞生成和抗炎反应为特征的dBRD9降解物的局部治疗可以有效地缓解或减轻ONJ。

为了验证这一假设，我们通过对6周龄WT C57BL/6J小鼠进行ZOL（125μg/kg；每周两次）和DEX（5μg/kg；每周一次）4周。第一次注射ZOL/DEX两周后，拔除小鼠上颌左第一磨牙。丝素蛋白（SF）具有良好的生物相容性和可控制的生物降解性，在骨组织工程中得到广泛应用。除了为各种化学线索提供合适的平台外，SF的可注射性和光固化特性使其成为口腔医学拔牙窝骨再生的理想生物材料。因此，我们构建了含BRD9降解物的改良可注射光固化SF，并在拔牙后立即将其填充到牙槽骨窝中，以含SF的载体为对照组。两周后，收集各组上颌骨进行评估（图8a）。

μCT成像对牙槽骨愈合的评估显示，ONJ对照组小鼠磨牙拔牙部位出现严重的骨膜反应（图8b，箭头1）、上颌窦底骨质疏松（图8b，箭头2）以及骨数量不足，充满骨硬化样和固片（图8b，箭头3）。而ONJ-dBRD9组小鼠的磨牙拔牙窝充满了组织良好的新形成的小梁骨（图8b），与ONJ-对照组小鼠相比，骨坏死和骨膜反应的发生率降低了80%（图8c）。组织学检查显示，dBRD9组拔牙窝愈合后骨组织结构良好且充满血管（图8d，箭头），对照组小鼠坏死的带空陷窝的牙槽骨（图8d，星号）明显减弱。

TRAP染色和定量分析显示，与对照组相比，dBRD9降解物处理组愈合的拔牙窝骨表面局部参与骨重构的破骨细胞增多（图8e, f）。iNOS免疫荧光染色（图8g），TNF-α（图8h）和CD86（图8i）显示，与对照组相比，dBRD9降解物处理组愈合的拔牙窝骨表面炎症反应局部缓解。应用dBRD9治疗ZOL诱导的ONJ的良好适应证促使我们研究其发病机制与BRD9在破骨细胞发生和巨噬细胞激活过程中的功能之间的潜在联系。

有趣的是，我们的初步数据显示，在RANKL诱导的破骨细胞发生和脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞激活过程中，ZOL治疗可导致BMDMs中BRD9的表达上调（图8j）。这一发现回顾了BRD9的作用机制，也提示dBRD9应用于ZOL诱导的ONJ是一种潜在的理想的致肿瘤治疗方法。不出所料，STAT1作为BRD9下游的关键靶点之一，在体内，与对照组相比，dBRD9降解物处理组STAT1下调（图8k）。

综合利用BRD9的药理学调节和柔性可注射SF生物材料支架的优势，我们设计了一种用于拔牙缺损的局部骨再生系统，有效预防和缓解ZOL相关的ONJ。这些结果与我们研究中证实的BRD9的分子机制相呼应，更重要的是为未来提供了一种有前景的预防或有效缓解ONJ的治疗策略。