Puromycin dihydrochloride  别名：Puromycin 2HCl; CL13900 dihydrochloride; 嘌呤霉素

盐酸嘌呤霉素Puromycin dihydrochloride (CL13900 dihydrochloride) 是一种氨基核苷类抗生素，作为蛋白质合成抑制剂。Puromycin有两种抑制作用模式。第一种是作为接受底物，攻击P位点的肽基tRNA，形成新生肽。第二种是通过与氨基酰-tRNA竞争结合到A'位点。

Puromycin对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用。对瞟吟霉素的抗性取决于编码瞟吟霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因。含pac基因的质粒/慢病毒转染/感染细胞后，细胞表达pac基因，因而获得Puromycin抗性，Puromycin即可用于细胞筛选。

使用方法

1、储存液制备

用20mM HEPES (pH7.4)溶液或蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成10 mg/ml的储存液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，按照单次用量分装，于-20℃冻存，避免反复冻融。

2、建议工作浓度

对于大多数哺乳动物细胞，Puromycin的工作浓度建议为1~10μg/ml，最佳浓度使用宿主细胞杀灭实验（杀灭曲线）来确定；

在正式实验前，建议先进行Puromycin敏感性检测预实验（确定能在3-5天杀死细胞的最优Puromycin浓度）；

细胞转染含pac基因的质粒，或感染含pac基因的慢病毒。24h（转染）或48h（慢病毒感染）后，细胞继续培养于含一定浓度Puromycin的培养基中（注意细胞不要太密，最好细胞密度不超过25%）。

大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选敏感转化菌株，使用浓度为100-125μg/ml。

注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌阳性转化子不仅需精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身状态影响。

3、杀灭曲线的建立

嘌呤霉素合适的筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、代谢情况，以及细胞所处周期等因素有关。为了筛选到稳定表达的细胞株，确定杀死未转染或感染细胞所需的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次实验一定要建立杀灭曲线（kill curve），筛选到适合自身实验体系的最优筛选浓度。

1）于24孔板加入500 μl/孔制备好的细胞悬液，铺足够的孔以保证后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜。理想情况开始抗生素筛选时，细胞达到较高的密度（~60-80%），常用的细胞密度如下：

贴壁细胞：0.8 - 3.0 x 10⁵cells/ml

悬浮细胞：2.5 - 5.0 x 10⁵cells/ml

2）准备筛选培养基：含梯度浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（比如，设置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml，这11个筛选浓度，每个浓度2个复孔）；

3）将孵育过夜的细胞清洗后，更换新鲜制备的梯度筛选培养基；之后置于37℃，5%CO2培养箱内孵育；

4）根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基；

5）每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非感染细胞的抗生素最低浓度，也就是将用到的最优筛选浓度。

注：如果发现细胞开始变圆但没有从平板表面脱落可能是以下情况，

a）变圆但是未脱落是细胞开始死亡的一个信号，这些需要更长的筛选时间；

b）若在建议浓度1-10μg/ml范围内还不能完全处死细胞，此时需要检测药物是否有效，避免药物的反复冻融（<5）。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。