Puromycin dihydrochloride 别名：Puromycin 2HCl; CL13900 dihydrochloride; 嘌呤霉素
盐酸嘌呤霉素Puromycin dihydrochloride (CL13900 dihydrochloride) 是一种氨基核苷类抗生素，作为蛋白质合成抑制剂。可用于构建肾病模型。
CAS No.：58-58-2
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化学性质/溶解性/储存
| 分子量 | 544.43 |
| 分子式 | C22H29N7O5.2HCl |
| CAS号 | 58-58-2 |
| 中文名称 | 嘌呤霉素 |
| 溶解性（仅列举部分溶剂） | Water ≥ 30 mg/mL |
| 储存条件 | -20°C, dry, sealed |
| 运输方式 | 冰袋运输，根据产品的不同，可能会有相应调整。 |
*不同实验中用到的溶剂可能不同，具体实验所需溶剂及溶解方法请参考相关文献描述。
生物活性
盐酸嘌呤霉素Puromycin dihydrochloride (CL13900 dihydrochloride) 是一种氨基核苷类抗生素，作为蛋白质合成抑制剂。Puromycin有两种抑制作用模式。第一种是作为接受底物，攻击P位点的肽基tRNA，形成新生肽。第二种是通过与氨基酰-tRNA竞争结合到A'位点。
Puromycin对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用。对瞟吟霉素的抗性取决于编码瞟吟霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因。含pac基因的质粒/慢病毒转染/感染细胞后，细胞表达pac基因，因而获得Puromycin抗性，Puromycin即可用于细胞筛选。
使用方法
1、储存液制备
用20mM HEPES (pH7.4)溶液或蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成10 mg/ml的储存液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，按照单次用量分装，于-20℃冻存，避免反复冻融。
2、建议工作浓度
对于大多数哺乳动物细胞，Puromycin的工作浓度建议为1~10μg/ml，最佳浓度使用宿主细胞杀灭实验（杀灭曲线）来确定；
在正式实验前，建议先进行Puromycin敏感性检测预实验（确定能在3-5天杀死细胞的最优Puromycin浓度）；
细胞转染含pac基因的质粒，或感染含pac基因的慢病毒。24h（转染）或48h（慢病毒感染）后，细胞继续培养于含一定浓度Puromycin的培养基中（注意细胞不要太密，最好细胞密度不超过25%）。
大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选敏感转化菌株，使用浓度为100-125μg/ml。
注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌阳性转化子不仅需精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身状态影响。
3、杀灭曲线的建立
嘌呤霉素合适的筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、代谢情况，以及细胞所处周期等因素有关。为了筛选到稳定表达的细胞株，确定杀死未转染或感染细胞所需的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次实验一定要建立杀灭曲线（kill curve），筛选到适合自身实验体系的最优筛选浓度。
1）于24孔板加入500 μl/孔制备好的细胞悬液，铺足够的孔以保证后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜。理想情况开始抗生素筛选时，细胞达到较高的密度（~60-80%），常用的细胞密度如下：
贴壁细胞：0.8 - 3.0 x 105cells/ml
悬浮细胞：2.5 - 5.0 x 105cells/ml
2）准备筛选培养基：含梯度浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（比如，设置0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10μg/ml，这11个筛选浓度，每个浓度2个复孔）；
3）将孵育过夜的细胞清洗后，更换新鲜制备的梯度筛选培养基；之后置于37℃，5%CO2培养箱内孵育；
4）根据细胞的生长状态，约2-3天更换新鲜的筛选培养基；
5）每日监测细胞，观察存活细胞率，从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非感染细胞的抗生素最低浓度，也就是将用到的最优筛选浓度。
注：如果发现细胞开始变圆但没有从平板表面脱落可能是以下情况，
a）变圆但是未脱落是细胞开始死亡的一个信号，这些需要更长的筛选时间；
b）若在建议浓度1-10μg/ml范围内还不能完全处死细胞，此时需要检测药物是否有效，避免药物的反复冻融（<5）。
注意事项
为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
实验参考
下述溶液配置方法仅为基于分子量计算出的理论值。不同产品在配置溶液前，需考虑其在不同溶剂中的溶解度限制。
| 浓度/溶剂体积/质量 | 1 mg | 5 mg | 10 mg |
|---|---|---|---|
| 1 mM | 1.8368 mL | 9.1839 mL | 18.3678 mL |
| 5 mM | 0.3674 mL | 1.8368 mL | 3.6736 mL |
| 10 mM | 0.1837 mL | 0.9184 mL | 1.8368 mL |
*吸湿的DMSO对产品的溶解度有显著影响，请使用新开封的DMSO；
请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
| 细胞系 | SH-SY5Y cells |
| 方法 | To stably silence HuR, HuB, or HuD, SH-SY5Y cells were infected with lentiviruses bearing vector expressing shHuR, shHuD or shHuB. Forty-eight hours later, cells were cultured in medium containing puromycin (1.5 μg/ml) and cultured for an additional 7 days. Cells then were cultured in medium containing puromycin (1.0 μg/ml) until cells were collected for experiments. |
| 浓度 | 1.5 μg/mL, 1.0 μg/mL |
| 处理时间 | 7 days |
* 上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献。
建议您制定动物给药及实验方案时，尽量参考已发表的相关实验文献（溶剂种类及配比众多，简单地溶解目的化合物，并不能解决动物给药依从性、体内生物利用度、组织分布等相关问题，未必能保证目的化合物在动物体内充分发挥生物学效用）。
体内实验的工作液，建议您现用现配，当天使用；如在配制过程中出现沉淀、析出现象，可以通过超声和（或）加热的方式助溶。
切勿一次性将产品全部溶解。
请在下面的计算器中，输入您的动物实验相关数据并点击计算，即可得到该实验的总需药量和工作液终浓度。
例如您给药剂量是10 mg/kg，平均每只动物的体重为20 g，每只动物的给药体积是100 μL，动物数量为20只，则该动物实验的总需药量为4 mg，工作液终浓度为2 mg/mL。
1：鉴于实验过程的损耗，建议您至少多配1-2只动物的量；
2：为该产品最终给药时的浓度。
| 动物模型 | Vitamin D receptor null mutant mice |
| 配制 | PBS |
| 剂量 | 0.040 μmol/g |
| 给药处理 | Intraperitoneal injection |
* 上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献。
延伸阅读 （仅做信息扩展，不作实验参考）
一、Puromycin(嘌呤霉素)的作用机制
在细胞内，蛋白质的合成是一个极其复杂且高度有序的过程，而Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）就如同一个 “捣乱分子”可以干扰这一关键进程。它的作用靶点主要是核糖体，通过模拟氨酰化 tRNA（aa-tRNA）的 3' 末端结构，巧妙地混入蛋白质合成的 “生产线” 中。正常情况下，氨酰化 tRNA 携带特定的氨基酸进入核糖体的 A 位点，参与肽链的延伸。而嘌呤霉素由于其结构与氨酰化tRNA的3'末端极为相似，能够以假乱真，代替正常的氨基酸进入核糖体。一旦Puromycin（嘌呤霉素）进入核糖体的A位点，核糖体肽基转移酶中心（PTC）就会将其催化掺入到新生肽链的C末端。然而，嘌呤霉素毕竟不是真正的氨基酸，它无法像正常的氨酰化 tRNA 那样参与后续的肽链延伸反应。这就如同在一条生产线上，突然混入了一个不符合标准的零件，导致整个生产流程被迫中断，翻译过程过早终止[1]。
图 1. Puromycin的作用机理[1]
二、应用领域
1. 抗性筛选
细胞转染是指将外源核酸（如 DNA、RNA 等）导入真核细胞内的过程。科研人员通常可将含有抗嘌呤霉素的基因（如 pac 基因，编码嘌呤霉素N-酰转移酶）的载体与目的基因重组后转入宿主细胞中。pac可乙酰化Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637），使其失去对蛋白质合成的抑制活性，从而赋予细胞对嘌呤霉素的抗性。通过在细胞培养基中加入Puromycin，实验人员可以通过筛选获得成功转染的细胞。在具体操作中需进行预实验以确定最佳筛选浓度。2014年，AbMole的两款抑制剂分别被西班牙国家心血管研究中心和美国哥伦比亚大学用于动物体内实验，相关科研成果发表于顶刊 Nature 和 Nature Medicine。
2. 蛋白质翻译研究
翻译水平的调节是重要的基因表达调控机制之一，涉及mRNA 翻译因子、核糖体蛋白、RNA 结合蛋白和非编码 RNA 的表达以及 RNA 二级结构、RNA甲基化和上游开放阅读框选择的调节变化。Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）是一种研究蛋白翻译的重要工具，当在细胞培养体系中以低浓度加入嘌呤霉素时，它能够特异性地掺入到新合成的肽链中。这一过程就像是给上述肽链贴上了一个特殊的“标签”，科研人员可以通过追踪这个 “标签” 来了解蛋白质合成的动态过程，通过可以特异性识别Puromycin的抗体进行免疫印记和免疫荧光等方式检测蛋白翻译的动态过程。此外，基于嘌呤霉素的检测与邻位连接 （PLA） 检测的结合（Puro-PLA），实验人员可以检测特异性 mRNA 的翻译。Puro-PLA：目的蛋白抗体和Puromycin的抗体各带有一段可以互补的核苷酸序列，当Puromycin作用于目的肽链上时，与目的蛋白的新生肽链间距较近，随后加入上述两种抗体，此时上述的两段核苷酸就会互补配对，随后通过滚环扩增（RCA）产生可检测的信号。
图 2. Puro-PLA的工作原理
3. 构建动物肾病模型
Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）在构建动物模型，尤其是肾病模型方面，有着重要的应用。以构建肾病动物模型为例，嘌呤霉素能够直接损伤肾小球上皮细胞。当给实验动物（如大鼠）注射嘌呤霉素后，它会作用于肾小球上皮细胞，使细胞骨架、细胞外基质蛋白、细胞表面整合素、硫酸化蛋白聚糖等物质发生结构和功能变化。同时，嘌呤霉素还会诱导肾小球固有细胞产生自由基，这些自由基会进一步破坏肾小球滤过膜，导致肾小球滤过膜的分子屏障功能降低。因此嘌呤霉素是一款经典的动物肾病实验造模剂[2]。
三、范例详解
1. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis.
科研人员构建了一个荧光素酶 （Gluc） 报告基因检测系统，以从中药配方SNS 中鉴定具有抗 I 型 IFN 活性的成分。并在 RAW264.7 细胞中，采用实时 PCR （RT-PCR） 和 Western blotting 研究 I 型 IFN 通路的变化。此外，在博来霉素 （BLM，AbMole，M13641）诱导的小鼠硬化症模型中，通过 RT-PCR 测量纤维化基因、I 型 IFN 相关基因、炎性细胞因子的表达，并通过 H&E 染色、Masson 染色和免疫组织化学分析确定组织病理学变化。最终结果表明芍药总葡萄糖苷 （TGP） 是 SNS 的生物活性成分，它选择性抑制 TLR3 介导的 I 型 IFN 反应,并阻断 I 型 IFN 诱导的下游 JAK-STAT 信号通路。在动物实验中，TGP 通过抑制 I 型 IFN 信号传导上游和下游的多个靶点来改善皮肤纤维化。在构建荧光素酶检测系统中，科研人员使用了由AbMole提供的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）用于细胞转染后的筛选[3]。
图 3. Establishment of Gluc reporter assay system and identification of
ingredients with anti-type I IFN activities[3].
2. Transl Oncol. 2023 Feb;28:101617.
科研人员在上述文章中探究了结直肠癌（CRC）对奥沙利铂（Oxaliplatin，AbMole，M2290）产生耐受性的机制，在实验中发现了KIAA1199 可以促进 CRC 的奥沙利铂耐药。从机制上讲，KIAA1199 可以通过连接O-GlcNAc 转移酶（OGT）和底物蛋白来促进蛋白质的O-GlcNAcylation ，进而可减轻内质网应激 （ERS） 并防止 CRC 细胞凋亡。同时，KIAA1199 还可以通过 O-GlcNAcylation稳定SNAI1蛋白来触发上皮间充质转化，促进CRC的转移。在实验设计中，科研人员还构建了KIAA1199和OGT敲低的稳定转染SW480 和HCT116细胞，在筛选中使用了来自AbMole的Puromycin（嘌呤霉素，AbMole，M3637）[4]。
图 4. Inhibition of PARP1 by olaparib reverses oxaliplatin resistance of CRC[4].
参考文献及鸣谢
[1] D. Zhang, Y. Gao, L. Zhu, et al., Advances and opportunities in methods to study protein translation - A review, Int J Biol Macromol 259(Pt 1) (2024) 129150.
[2] M. Xiao, B. N. Bohnert, F. Grahammer, et al., Rodent models to study sodium retention in experimental nephrotic syndrome, Acta physiologica (Oxford, England) 235(3) (2022) e13844.
[3] M. Wang, Y. Bai, D. Jiang, et al., A novel HOIP frameshift variant alleviates NF-kappaB signalling and sensitizes cells to TNF-induced death, Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease 1870(7) (2024) 167355.
[4] Q. Hua, Y. Lu, D. Wang, et al., KIAA1199 promotes oxaliplatin resistance and epithelial mesenchymal transition of colorectal cancer via protein O-GlcNAcylation, Translational oncology 28 (2023) 101617.
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参考文献
以上参考文献由AI整理，仅供参考，AbMole 尚未独立确认这些文献的准确性。
