AbMole重磅推荐—Atezolizumab和 Avelumab揭示抗体诱导ADCC抑制肝细胞癌新机制

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由来自中山大学的JiZhou Tan，JiaPing Li以及广州中医药大学的YuanQing Zhang等多名研究人员在Acta Pharm Sin B期刊（IF=14.5）上，共同发表了题为“Anti-PD-L1 antibody enhances curative effect of cryoablation via antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity mediating PD-L1highCD11b+ cells elimination in hepatocellular carcinoma”的研究成果，在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的Atezolizumab（M6101）和 Avelumab(M3813)，揭示了 PD-L1 抗体通过诱导 NK 细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）效应，从而清除PD-L1highCD11b+细胞的新机制，并为冷冻消融与PD-L1阻断联合应用于肝细胞癌的相关研究提供了依据。

冷冻消融（CRA）和微波消融（MWA）是肝细胞癌（HCC）的两种主要研究方法。然而，哪种效果更好且更适合与免疫方法相结合仍存在争议。

有研究报道，射频消融（RFA）会引发局部炎症，导致浸润肿瘤微环境的免疫抑制性CD11b+髓系细胞增加，从而阻碍消融术后免疫研究的效果。研究人员首先收集接受CRA和MWA后的HCC患病受试者的临床样本，发现MWA组PD-L1+CD11b+细胞显著增加，而CRA组中PD-L1+肿瘤细胞显著增加（图1A，B）。随后研究人员建立BALB/c小鼠模型，发现与MVA组相比，CRA组中T细胞浸润频率较高，PD-L1highCD11b+细胞较少（图1C-E），并且肿瘤细胞PD-L1表达上调，说明CRA在抗PD-L1联合应用方面可能比MVA更有潜力。

图 1 A. 消融后第14天，对CRA/MWA患病受试者的肿瘤活检样本进行免疫荧光染色。B. 每1 mm2视野中PD-L1+肿瘤细胞和PD-L1+CD11b+细胞的数量。C-E. CD45+、CD3+T细胞和CD11b+髓系细胞的数量。

接下来，研究人员在CRA和MWA消融后使用PD-L1抗体（图2A）处理。H&E染色（图2D）和总体生存曲线（图2E）结果显示，CRA+抗小鼠PD-L1（CRA+a-PDL1）组的肿瘤体积较其他组明显缩小（图2B，C），坏死面积最大且预后优于其他组，说明联合应用抗PD-L1抗体能提高CRA的效果，并且比联合MWA的效果更好。

图 2 A. 动物实验示意图。将H22细胞皮下注射到BALB/c小鼠体内。12天后，进行冷冻消融或微波消融，同时通过尾部注射抗小鼠PD-L1抗体，每3天注射一次，每次10 mg/kg。两周后，处死所有小鼠。B-C. 6组小鼠的肿瘤重量。D. 肿瘤组织切片的H&E染色。红线代表肿瘤活区和坏死区的边缘。E. 6组小鼠的存活率。

通过流式细胞术分析，研究人员发现CRA+a-PDL1组CD3+CD8+T细胞的频率明显增加，新抗原特异性标志物CD39表达升高，IFN-γ分泌增加，抗肿瘤活性更强。免疫荧光图像显示，CRA+a-PDL1处理后，CD11c+CD11b-细胞（即cDC1细胞）的频率增加（图3E，F），CXLC9增多，同时CD8+T细胞招募也增加（图3A，B），且CXCL9主要cDC1细胞产生（图3C，D）。随后使用动物模型进一步研究，发现应用抗CXCL9能明显抑制CRA+抗-PD-L1对HCC小鼠模型的效果（图3G，H），表明抗-PD-L1能通过增强cDC1的CXCL9分泌，从而促进CRA后CD8+T细胞的募集。

图 3 A. 肿瘤组织切片的免疫荧光染色。B. 6组小鼠中发现的CD8+T细胞和CXCL9+点在每个视野中的百分比。C-D. 肿瘤微环境中不同类型细胞门控CXCL9频率的代表性流式细胞术分析。E-F. 对肿瘤浸润的CD45+细胞标记的CD11c+CD11b-cDC1细胞进行流式细胞术定量分析。G-H. 将H22细胞皮下注射到BALB/c小鼠体内。12天后，进行冷冻消融或微波消融，每3天通过尾部注射抗小鼠CXCL9中和抗体（10 mg/kg）或抗小鼠PD-L1抗体（10 mg/kg）。

进一步研究发现，a-PDL1组和CRA+a-PDL1组CD49b+NK细胞在肿瘤微环境中的浸润增加，抗肿瘤活性提高（图4A-C）。给小鼠模型注射ADCC阻断抗体（抗CD16抗体）后，发现能明显降低CRA+抗-PDL1联合处理的效果（图4D）。此外，与CRA+anti-PDL1组相比，CRA+anti-PDL1&anti-16组的NK细胞更少，CD11b+髓系细胞的信号也更弱（图4E），表明CRA和抗PD-L1抗体的联合应用能通过NK介导的ADCC作用减少PD-L1highCD11b+髓系细胞的数量，从而改善消融术后的免疫抑制微环境。

图 4 A-B. 流式细胞图。C.各组CD49b+（NK）和Granzyme B+的流式细胞计数定量。D. 将H22细胞皮下注射到BALB/c小鼠体内。12天后进行冷冻或微波消融，每3天通过尾部注射注入相应的抗体。抗小鼠CD16中和抗体的ADCC阻断试验。E. 肿瘤组织切片的免疫荧光染色。

最后，通过对比Atezolizumab和 Avelumab两种抗体的作用效果，发现具有野生型Fc区的 Avelumab可以诱导更强的NK介导的ADCC效应，从而更好的消除肿瘤浸润的PD-L1highCD11b+细胞和PD-L1high肿瘤细胞。

该研究使用了购自AbMole的Atezolizumab（M6101）和Avelumab(M3813)两种PD-L1抗体，Atezolizumab为Fc区N298A点突变抗体，消除了ADCC效应，而野生型Fc区PD-L1抗体 Avelumab则具有ADCC效应。

流式细胞仪分析结果显示，Avelumab对小鼠NK细胞上的CD16有更强的亲和力，小鼠WT抗体和 Avelumab能有效偶联NK细胞（图5A）。进一步研究发现（图5B），只有 Avelumab能诱导NK介导的ADCC效应。

图 5 A. 不同抗PD-L1抗体与人源化Fc片段或鼠Fc片段对小鼠NK细胞CD16分子的亲和力。B. 从接受CRA处理的HCC小鼠模型中收集残余肿瘤和自体脾脏。然后分选肿瘤或脾脏中的CD11b+髓系细胞以及肿瘤细胞作为靶细胞。NK细胞首先与CD16和Fc片段结合抗体孵育30分钟，然后与靶细胞以2:1的E:T比共培养24小时。以1:1000的比例加入Golgi-stop以停止细胞因子的分泌。

随后体内试验的结果显示，与CRA+Atezolizumab组相比，CRA+ Avelumab组的肿瘤体积更小（图6A）。且 Avelumab组CD11b+细胞浸润区域出现更多的荧光，表明 Avelumab诱导了髓系细胞的凋亡（图6B）。并且进一步研究发现，外周髓系细胞和抗原递呈细胞的PD-L1表达水平低于PD-L1high的CD11b+细胞，因此应用Avelumab诱导的ADCC效应不会对肿瘤cDC1细胞和外周循环中的髓系细胞产生负面影响。

图 6 A. CRA与不同抗体联合处理肿瘤小鼠的体内实验。B. 肿瘤组织切片的免疫荧光染色。

综上所述，该研究表明在体内，CRA与PD-L1阻断联合作用的效果优于MWA。同时还揭示了抗PD-L1抗体通过增加cDC1细胞分泌CXCL9促进CD8+T细胞浸润，以及通过ADCC作用增强NK细胞清除PD-L1highCD11b+细胞的新机制。此外，研究结果表明野生型PD-L1抗体Avelumab比突变型Atezolizumab更能诱导针对PD-L1highCD11b+细胞的ADCC效应。该研究为阻断PD-L1联合CRA攻克HCC提供了一种新策略。

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鸣谢：Tan J, Liu T, Fan W, et al. Acta Pharm Sin B. 2023;13(2):632-647.