AbMole重磅推荐—Alirocumab揭秘HTR期间肝脏免疫调节新机制

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近日由来自华中科技大学同济医学院附属协和医院的Xi Zhang，Heng Xu，Jie Wu和Jiahong Xia等多名研究人员在Circulation期刊（IF=37.8）上，共同发表了题为“Immune Regulation of the Liver Through the PCSK9/CD36 Pathway During Heart Transplant Rejection”的文章。在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的Alirocumab（阿利珠单抗，M3835），揭示了心脏移植排斥反应（HTR）期间肝脏通过PCSK9/CD36通路进行免疫调节的新机制，并提示对该通路的调节可能是预防HTR的潜在研究靶点。

对于心脏移植患者，HTR是患者存活的主要障碍，其特征是促炎巨噬细胞和效应T细胞大量浸润，并伴有心肌细胞损伤。以前的研究通常集中在免疫细胞，但是非免疫器官和相关分子在心脏移植排斥反应中的作用尚未明确。

在该文章中通过分析临床患者（如图1A所示），以及完全MHC错配小鼠心脏移植后的血清数据，均发现在HTR期间血清PCSK9水平升高。通过对移植受体小鼠进行多器官筛选和多组学分析，发现在同种异体受体小鼠中，Pcsk9 mRNA在肝脏的表达明显高于其他器官（图1B-D）。

图 1 A ,在静脉注射甲基强的松龙（IVMP）前后，通过ELISA检测心脏移植排斥者的血清PCSK9水平。B，从异体组小鼠的受体器官中提取总RNA并反转录成cDNA。通过qPCR检测Pcsk9相对于Gapdh的mRNA表达水平（n=4）。C，对受体小鼠的移植物和肝脏进行PCSK9的免疫组化染色。比例尺，100μm。D，进行Western印迹检测PCSK9在受体小鼠肝脏中的表达，并使用GAPDH作为内参。

之后，对移植后受体小鼠的血清进行了多重细胞因子检测，发现促炎症细胞因子、VCAM-1和M-CSF水平明显增加（图2A）。在体外用这些细胞因子刺激原代小鼠的肝细胞，得出了TNF-α和IFN-γ能诱导PCSK9的mRNA表达（图2B）的结论。

图 2 A , 在心脏移植后第6天，从同源（B6到B6小鼠，同源组）和异源小鼠（BALB/c到B6小鼠，异源组）中收集血清。用ABplex Mouse 18-Plex Custom Panel检测小鼠血清中的多种细胞因子和趋化因子（n=2）。B，从B6小鼠中分离出原代肝细胞，用PBS、TNF-α或IFN-γ培养24小时，并收集Pcsk9 mRNA，用qPCR测定进行分析（n=3）。

此外，研究人员还进行了体内研究，通过构建心脏转基因动物模型进行实验，实验结果显示，在HTR期间，Tnf或Ifn缺乏不仅能抑制受体肝脏SREBP2的表达，还可以降低肝脏Pcsk9 mRNA的表达和血清PCSK9水平(图3A和3B)，并得到TNF-α和IFN-γ能通过SREBP2协同促进肝细胞中PCSK9的表达(图3C)的结论。

图 3 A和B，在心脏移植后第6天收集受者的肝脏和血清。A, 肝脏中SREBP2的mRNA和蛋白水平通过qPCR（n=4）和WB测量。B, 肝脏中SREBP2的mRNA水平通过qPCR测定，血清中PCSK9的水平通过ELISA测定（n=4）。C，细胞因子（TNF-α和IFN-γ）和信号通路（P65和STAT1）通过转录因子SREBP2调节肝细胞中PCSK9表达。

然后，又通过分析包含人心内膜活检数据的微阵列数据集，发现只有CD36的表达在排斥和无排斥移植的心内膜活检中明显不同（图4A，B）。且经单细胞RNA-seq分析，发现CD36主要在移植物浸润巨噬细胞中表达(图4C，D)。

图 4 A-B，分析了人心脏移植活体组织的微阵列数据。A，M-versus-A图显示排斥组和非排斥组的差异表达基因（DEGs，LFC>1，Padjusted<0.05）。PCSK9的靶点，包括LDLR、LRP1、LRP5、LRP8、VLDLR和CD36，被标记出来。B，散点图显示排斥组和非排斥组之间CD36的表达。C-D，在具有完全MHC错配的小鼠中进行心脏移植（BALB/c到B6）。移植后第6天收集异体移植物，并将移植物中的CD45+细胞分类，进行10×基因组学单细胞RNA测序。C，tSNE图描述了心脏浸润的CD45+免疫细胞被分成5组。D，热图显示每个簇中Cd36的表达情况。

通过比较用PCSK9处理的腹膜巨噬细胞和对照组，观察到MHCII和共刺激分子表达增加（图5A），以及CD36的表达和脂肪酸的吸收减少（图5B）。结果表明PCSK9不仅能控制CD36表达和脂肪酸摄取，还可以增强巨噬细胞的促炎表型和功能。从而揭示了在HTR期间，肝脏通过PCSK9/CD36通路进行免疫调节的新机制，以及该通路可能是HTR的潜在研究靶点。

图 5 A, 腹腔巨噬细胞中MHCII、CD80、CD86和CD40的荧光强度值的代表性FACS直方图和条形图（n=4）。B, 腹膜巨噬细胞中CD36表达（左侧，n=5）和BODIPY（右侧，n=5）的代表性FACS直方图和柱状图。

在实验中，多次使用购自AbMole的Alirocumab (阿利珠单抗，M3835)，Alirocumab是一种全人源的IgG1型PCSK9单抗，通过使用Alirocumab中和B6小鼠的PCSK9，可以延长小鼠的心脏移植存活率，并能减少CD4+、CD8+ T细胞和巨噬细胞的浸润，明显降低移植物中编码免疫细胞、转录因子和与炎症有关的细胞因子的基因水平，并且，Alirocumab在延长异体移植存活率和减弱异体移植排斥反应方面的表现，明显优于他汀类化合物洛伐他汀（图6)。此外，作者还发现用单克隆抗体Alirocumab中和PCSK9会导致小鼠血清PCSK9水平显著升高。从而得出了PCSK9参与心脏移植后的同种免疫反应的结论。

图 6 用Alirocumab（200μg/小鼠，腹腔注射，每2天一次，从心脏移植当天开始）、人IgG1同种型对照或洛伐他汀（100μg/小鼠，每天腹腔注射，从心脏移植当天开始（n=5；log-rank检验）给药的心脏异体移植的生存曲线。根据2004年ISHLT指南对细胞排斥进行评分（n=6；Kruskal-Wallis检验）。

之后，通过使用Cd36–/–小鼠作为心脏移植模型中的受体，并给予Alirocumab处理。如图7A所示，发现在Cd36敲除小鼠中，使用单克隆抗体对心脏移植物长期存活的能力减弱。由于CD36也在心肌细胞上表达，为了研究上述结果是否与供体心脏中CD36的表达有关，又通过构建HTR小鼠模型，并用同种型IgG1或Alirocumab作用于受体小鼠(图7B)。发现Alirocumab在该模型中显著延长了心脏同种异体移植物的存活时间(图7C)。从而得到PCSK9消融对HTR的保护作用是CD36依赖性的结论。

图 7 A，给药Alirocumab的WT和Cd36-/-小鼠异体移植的生存曲线（n=5）。B-C，将WT B6和Cd36-/-小鼠（B6背景）的心脏移植到BALB/c小鼠体内，无论是否给药Alirocumab B, 动物模型研究的工作流程示意图。C, 是否给药Alirocumab的WT和Cd36-/-小鼠异体移植的生存曲线（n = 5, log-rank检验）。

通过多项实验，研究人员发现，在HTR期间，TNF-α和IFN-γ通过转录因子SREBP2协同促进PCSK9在肝细胞中的表达，导致血清中PCSK9水平升高。增加的PCSK9抑制了CD36的表达和巨噬细胞对脂肪酸的吸收，有利于促进供体反应性T细胞的增殖和IFN-γ的产生（图8）。该研究揭示了HTR期间肝脏通过PCSK9/CD36途径进行免疫调节的新机制，并且表明该途径的调节可能是HTR的一个潜在研究靶点，为PCSK9在同种异体免疫中的作用提供了新的见解。

图 8 在HTR过程中，肝细胞和移植物浸润巨噬细胞之间通过PCSK9/CD36途径相互作用的模型。

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鸣谢：Zhang, Xi et al. “Immune Regulation of the Liver Through the PCSK9/CD36 Pathway During Heart Transplant Rejection.” Circulation, 10.1161/CIRCULATIONAHA.123.062788. 26 May. 2023, doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.123.062788