近日由来自中国科学院生物物理研究所的Lin Jing，北京科学技术研究院的YunHe An，以及中国科学院的TanXi Cai等多名研究人员在Cell Mol Immunol期刊（IF=24.1）上，共同发表了题为“A subpopulation of CD146+ macrophages enhances antitumor immunity by activating the NLRP3 inflammasome”的文章。在该文章中，研究人员使用了AbMole的BayK8644（M5073）与Stattic（M3032）两种产品，揭示了CD146+TAMs的抗肿瘤作用，并为开发癌症免疫治疗的方法提出了新的策略。
肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）决定着免疫疗法的疗效。然而，由于对其表型和功能异质性的了解有限，限制了其在肿瘤免疫治疗中的应用。据报道，分化簇146 (CD146)与癌症和慢性炎症疾病等病理状况有关，并且具有调节免疫细胞(如T细胞和巨噬细胞)的功能。
通过对小鼠和人类肿瘤组织中的CD146+巨噬细胞进行染色，发现CD146+巨噬细胞主要存在于肿瘤邻近组织（图1A）。之后通过Western（图1B）在肿瘤细胞条件培养基(TCM)刺激的巨噬细胞中检测到了强烈的STAT3活化，且STAT3的活化随着TCM刺激时间的延长而增加（图1C）。而经转录因子（TF）敲除分析表明，CD146受STAT3负调控(图1D)。因此可说明，随着肿瘤的生长，CD146通过肿瘤微环境（TME）诱导的STAT3激活而下调。
图1 A. 人肝脏样本中CD68的免疫染色。B. WB检测用或不用TCM刺激20分钟后，BMDMs中p-STAT3和STAT3的表达水平。C. WB检测使用TCM刺激后，BMDMs中p-STAT3、STAT3和ARG1蛋白的表达水平。ARG1作为巨噬细胞M2极化标记，β-Actin作为上样内参。D. 通过TF敲除分析表明，TF调控CD146的表达。
接下来，研究人员通过建立肿瘤模型进行实验（图2A），并发现巨噬细胞CD146条件性敲除小鼠（M-KO）的巨噬细胞主要通过招募髓源性抑制细胞（MDSCs）到TME来促进肿瘤的发展。之后通过进行体外转运（图2B）和RT-PCR等实验，发现CD146-KO巨噬细胞主要通过产生趋化因子来促进MDSC的招募。
图 2 A. 共注射肿瘤模型。B. 体外MDSC迁移试验示意图。
然后，研究人员用TCM刺激巨噬细胞，并分析信号通路的激活情况，观察到对比起野生型，敲除CD146后TCM对JNK通路的活化能力增强（图3A，B）。且经实验发现，JNK抑制剂能阻断MDSCs的招募（图3C），表明巨噬细胞上的CD146下调或缺失能通过激活JNK通路，促进MDSC招募相关趋化因子的表达，从而增强肿瘤免疫抑制。
图3 A. WB分析巨噬细胞中p-JNK、p-p38、p-ERK、p-p65和p-STAT3的水平。总JNK、p38、Erk、p65和STAT3蛋白作为对照。B. TCM刺激下巨噬细胞中p-JNK/JNK、p-p38/p38、p-ERK/ERK、p-p65/p65和p-STAT3/STAT3比率的定量分析（n = 3）。C. JNK抑制剂处理的巨噬细胞诱导的MDSC迁移（n = 3）。
通过蛋白质组学分析，发现跨膜蛋白176B（TMEM176B）在M-KO巨噬细胞中明显上调（图4A）。同时TMEM176B也被报道能抑制Caspase-1的活化和IL-1β的成熟，且两者都是炎症小体活化的标志。因此，研究人员测量了野生型小鼠（WT）和CD146-KO巨噬细胞中相关指标（如图4B），发现CD146的缺失能上调TMEM176B的表达并抑制NLRP3的激活。
图 4 A. 比较Hepa-TCM处理的M-WT和M-KO巨噬细胞蛋白质表达水平的火山图。B. 用LPS（10 ng/ml）和/或TCM刺激M-WT或M-KO巨噬细胞12 h，然后用5 mM ATP刺激1.5 h，对细胞裂解液或上清液中的actin、NLRP3、pro-IL-1β、pro-Caspase-1、IL-1β和Caspase-1进行WB分析。
之后研究人员使用Bayk8644抑制TMEM176B，并用ELISA对趋化因子的水平进行检测，发现抑制TMEN176B可以减少部分相关趋化因子的分泌（图5A）。由此得出结论：TAMs中CD146的下调能通过促进JNK信号的激活，从而上调TMEM176B和MDSC招募相关趋化因子的表达，进而加速肿瘤的发展（图5B）。
图 5 A. 在BayK8644存在的情况下，使用ELISA 检测TCM刺激巨噬细胞72小时后上清液中的CCL2、CCL3、CCL4、CXCL2以及CXCL5。B. CD146+巨噬细胞在肿瘤发生中的作用机制示意图。
最后将TMEM176B抑制剂和抗CD146抗体AA98联合应用于肿瘤治疗，发现联合使用是一种很有前景的肿瘤治疗策略。并且STAT3抑制剂能进一步提高抗肿瘤效率（图6A-C）。总之，调节TAMs的功能可以提高抗CD146抗体在肿瘤治疗中的效率，为基于TAMs的肿瘤治疗提供了一种新策略。
图 6 A-B 给药PD-1抗体的M-WT和M-KO小鼠以及给药AA98和/或PD-1抗体的 WT小鼠（A）中MC38肿瘤生长和抑制（B）（n = 5）。C. 每周两次给药AA98、STAT3抑制剂（STAT3 I）和/或BayK8644的C57小鼠中MC38肿瘤生长情况（n = 5）。
该研究使用了购自AbMole的Stattic（M3032）和Bayk8644（M5073）两种产品，其中Stattic是一种有效的 STAT3 抑制剂，而Bayk8644是免疫调节阳离子通道TMEM176B的抑制剂。
通过使用Stattic处理小鼠，发现肿瘤CD146+巨噬细胞的比例增加（图7A）。为了测试Stattic的抗肿瘤活性是否取决于巨噬细胞上的CD146表达，又用Stattic处理了带瘤的M-WT或KO小鼠。如图7B，C所示，Stattic对M-WT小鼠的肿瘤生长的抑制率约为50%，对M-KO小鼠的抑制率约为30%。这些数据表明，巨噬细胞CD146的表达至少部分受到TCM诱导的STAT3信号转导的控制，并证明了STAT3抑制剂可以通过抑制巨噬细胞中CD146的下调，从而维持巨噬细胞的抗肿瘤活性，为在癌症研究中靶向STAT3提供了证据。
图 7 A. FACS分析STAT3抑制剂处理小鼠和对照小鼠（n = 5）的F4/80+或CD146+ F4/80+细胞百分比。B. 各组Hepa1-6肿瘤发生情况（n = 5）。C. STAT3抑制剂对M-WT或M-KO小鼠肿瘤的抑制作用（n = 5）。
此外，实验中多次使用TMEM176B抑制剂BayK8644，通过用BayK8644处理M-KO小鼠，发现BayK8644能显著增加Caspase-1活化和IL-1β成熟（图8）。与其他实验结果共同表明CD146参与了炎症小体的激活，且至少部分通过TMEM176B发挥作用。
图 8 在Bayk8644存在的情况下，用TCM刺激BMDMs 12 h，WB分析细胞裂解液或上清液中的pro-IL-1β、pro-Caspase-1、IL-1β和Caspase-1。
接下来通过使用ELISA来评估TMEM176B抑制后的趋化因子水平，发现巨噬细胞中CD146的缺失会上调TMEM176B和一些趋化因子（如CXCL2和CXCL5）的表达，同时TMEM176B的表达也会控制其他趋化因子（如CCL2、CCL3和CCL4）的表达（图9A），且Bayk8644也能部分阻断体外M-KO诱导的MDSC转运（图9B）。
图 9 A. 在BayK8644存在下，用TCM刺激巨噬细胞72小时的上清液进行ELISA实验，检测CCL2、CCL3、CCL4、CXCL2和CXCL5。B 在BayK8644存在下巨噬细胞趋化诱导的MDSC迁移（n = 3）。
此外，研究人员还建立了M-WT和M-KO小鼠的肿瘤模型，通过给药BayK8644（图10 A，B），并用流式细胞术（FCM）进行分析（图10C），发现M-KO小鼠的肿瘤发展至少部分依赖于TMEM176B的表达。
图 10 A-B BayK8644对携带MC38肿瘤的M-WT或M-KO小鼠（n = 5）中肿瘤生长（A）或抑制（B）情况。C. 用BayK8644处理或不处理的M-WT和M-KO小鼠肿瘤中CD11b+Gr-1+、CD4+、CD8+和F4/80+细胞群的FACS分析（n = 5）。
由于CD146+巨噬细胞在肿瘤预防中起着重要作用，而巨噬细胞上CD146的缺失会上调TMEM176B的表达，因此研究人员将TMEM176B抑制剂和CD146抗体AA98联合应用。如图11A，B所示，AA98+BayK8644联合应用可抑制80%的肿瘤生长。且CD11c+细胞的比例在联合治疗组明显增加（图11C，D），表明抗CD146抗体和TMEM176B抑制剂的联合应用是一种很有前景的肿瘤治疗策略。并且STAT3抑制剂Stattic能进一步提高单独使用AA98或AA98+TMEM176B抑制剂的抗肿瘤效率（图6C）。总之，这些数据表明，调节TAMs的功能可以提高抗CD146抗体在肿瘤免疫中的效率。
图 11 A-B每周两次给药AA98和/或BayK8644（1 mg/kg）的C57小鼠中，MC38肿瘤的体积（A）和重量（B）（n = 5）。C-D FCM分析CD146+ TAMs（C）和MDSCs、CD4+、CD8+ CD11b+F4/80+和CD11b+CD11c+在从肿瘤分离的CD45+白细胞总数中的百分比（D）（n = 5）。
在该研究中，研究人员阐明了TAMs重塑TME的机制，揭示了CD146+ TAMs的关键抗肿瘤作用，为癌症免疫治疗的TAMs靶向策略提供了新的见解。
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鸣谢：Jing L, An Y, Cai T, et al. Cell Mol Immunol (2023). https://doi.org/10.1038/s41423-023-01047-4
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