SM-102  别名：SM102

SM-102 是一种可电离的氨基脂质，其头部基团含有一个末端羟基，可以减少头部基团的水化作用，提高与核酸的氢键相互作用，从而提高转染能力。SM-102可用于制备脂质纳米颗粒 (LNPs)，以及用于脂质纳米颗粒递送 mRNA 疫苗的相关研究。

微流控混合方式制备核酸脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）

一、实验原理：

ALC-0315、 MC3、和 SM102 是三种可用于人体的脂质。在酸性条件下，质子化形成阳离子脂质，能够通过静电作用和带负电的 mRNA 结合。脂质与溶有mRNA的水性溶液混合后析出，自组装形成载有 mRNA 的脂质纳米颗粒。本实验中采用微流控混合法，让脂质溶液与mRNA溶液在微混合器中充分、迅速、高度可重复地形成粒径均一可控的LNP。在制备过程中，脂质溶解于乙醇，核酸溶解于酸性缓冲液中，故制备得到的LNP初产物含有高浓度乙醇。因此后续还需要透析或者超滤去除残余的乙醇并将溶液体系置换至中性缓冲液中，以备后续生物学实验及长期保存。

二、实验步骤

1. 配制复方脂质-乙醇溶液：LNP的成分与分子量见下表：

所有成分总浓度配置成 12 mM（约7.5 mg/ml）。如果需要摸索磷脂浓度对 LNP *终粒径的影响条件，可以配制以下浓度：8 mM（约 5 mg/ml）、12 mM（约 7.5 mg/ml）和 16 mM（约 10 mg/ml）等进行测试。需注意，低于4mM会难以形成均一的LNP，而过高浓度的磷脂反而会导致LNP粒径的增大。不同磷脂浓度对LNP粒径的影响见 附录-附件1。我们推荐使用12mM浓度的磷脂作为实验的起始条件。

备注 ：配置好的磷脂溶液可于4℃密封保存半年。再次使用前请平衡至室温，直至溶液澄清。阳离子磷脂保存条件比较苛刻 ，常温下接触空气后会发生氧化变质，受潮则易析出。直接结果为合成 LNP时粒径出现异常增大（如粒径增大一倍以上），请确保妥善密封保存。

2. 配制柠檬酸缓冲液

使用超纯水分别配制 100 mM 的一水合柠檬酸(分子量:210.14 ，称取 1.05 g)和二水合柠檬酸钠(分子量:294.10 ，称取 1.47 g)溶液各 50 ml 。取 33.0 ml 柠檬酸溶液和 17.0 ml 柠檬酸钠溶液混合，用NaOH调至pH =4 。随后用超纯水定容至 100 ml，加入终浓度0.1% 的DEPC静置30分钟。 高压灭菌去除 DEPC，即得 50 mM柠檬酸缓冲液。柠檬酸缓冲液与乙醇配置的磷脂，需要分别用0.22 μm的混合纤维素酯微孔滤膜（柠檬酸缓冲液）与PTFE滤膜（乙醇配置的磷脂）分别过滤，确保其终产物不含微小的固态颗粒（包封试剂盒内含100mM柠檬酸缓冲液，稀释后可直接使用）。

3. 计算RNA浓度，配制 mRNA-柠檬酸缓冲液：

氮磷比（N/P）是mRNA-LNP包封中常用的计算核苷酸用量与磷脂用量的参数。每个碱基含有一个磷酸根，1 mol的RNA或DNA即含有1mol的磷酸根（P）。磷脂中仅以可电离脂质比例计算氮原子数，每摩尔复方脂质中含有 0.5 mol氮原子（N）。

备注：虽然大多数的配方推荐的N/P比为6，但是实验表明，在后续的混合和超滤过程中，会损失一定的磷脂。所以在实践中，我们推荐您（可根据实验需要）将N/P比提高为8。更高的N/P比可以降低超滤和透析引起的粒径变大，并提高 mRNA 的利用率。缺点是可能会增大对细胞的毒性 ，降低细胞的存活率。对于包封率，高N/P比也并无优势。

核糖核苷酸的平均分子量为339.5，形成RNA脱水聚合后NEB推荐计算均值为320.5 g/mol。脱氧核糖核苷酸的平均分子量为327.0，形成双链DNA脱水聚合后，NEB推荐计算均值为308.0 g/mol。以可电离脂质比例计算氮原子数，每摩尔复方脂质中含有 0.5 mol氮原子。

以柠檬酸缓冲液/复方磷脂流速比（FRR）= 3、N/P = 6、磷脂浓度 = 12 mM为例，进行核酸使用量的计算：

柠檬酸钠缓冲液中RNA浓度：(26.71 × 12) / 3 = 106.84 ng/μL；

柠檬酸钠缓冲液中DNA浓度：(25.67 × 12) / 3 = 102.68 ng/μL。

常用复方磷脂浓度与缓冲液中核酸浓度对应表

使用超纯水分别配制100 mM的一水合柠檬酸(分子量:210.14，称取1.05 g)和二水合柠檬酸钠(分子量:294.10，称取1.47 g)溶液各50 ml。

取33.0 ml柠檬酸溶液和17.0 ml柠檬酸钠溶液，混合后加入DEPC，静置30分钟后高压灭菌去除DEPC，灭菌后使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的柠檬酸缓冲液。

将mRNA测定浓度后根据脂质浓度使用柠檬酸缓冲液稀释至所需浓度。

4. 微流控混合：

4.1. 装配微流控混合芯片和夹具

4.2. 预冲洗管路和微混合芯片：

预冲洗保证微混合芯片内部已经预先充满乙醇和柠檬酸缓冲液。

① 将无水乙醇和柠檬酸缓冲液通过0.22微米微孔滤膜过滤。

② 将无水乙醇吸入3 ml注射器中（吸入体积约0.7 ml），将柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中（吸入体积约2.1 ml），并排出注射器中的空气。在注射器上标注“乙醇”和“缓冲液”。

4.3. 微流控混合制备LNP：

4.4. 透析（或者超滤）与储存：

透析：

4.4.1. 样品收集后，使用动态光散射仪测定LNP粒径和均一度。

4.4.2. 产物在制备后用注射器直接将产物移入透析卡（推荐使用Thermo的Slide-A-Lyzer™ 透析盒，20 K MWCO）或20 KD预处理过的透析袋。

4.4.3. 将装有LNP初产物的透析卡或透析袋置于至少50倍体积1 x PBS（pH=7.4），或50倍体积20 mM Tris-HCl（pH=7.4）于4℃透析2h。

4.4.4. 将透析液更换为50倍体积，含有10% 蔗糖 的PBS（pH=7.4），或50倍体积，含有8% 蔗糖的20 mM Tris-HCl（pH=7.4）于4℃透析过夜。

4.4.5. 透析后LNP终产物可于4℃或-20℃进行保存。

4.5. 超滤
4.5.1. 样品收集后 ，加入3倍体积的柠檬酸缓冲液稀释。

备注 ：不建议直接使用 PBS 或者 Tris 缓冲液稀释 ，过快改变 LNP 外环境 pH 会造成不可控的粒径/PDI的增大。

4.5.2. 使用 Milipore 30 kD 超滤管，3000 g离心10 min，超滤至原体积的 1/4。（使用过小孔径的超滤管会使得超滤困难，超滤时间延长。不建议使用10kD或更小的超滤管。）

4.5.3. 补加1 x PBS（或20 mM Tris-HCl）至原体积 ，再次超滤10 min，至原体积 1/4。

4.5.4. 重复步骤 3 两次 ，将乙醇含量降低至 0.5%以下。

4.5.5. *后一次使用含有蔗糖保护液的缓冲液超滤浓缩，使得PBS缓冲液的终产物中含有10%的蔗糖（Tris-HCl缓冲液终产物含有8%蔗糖）。

4.5.6. 将超滤后的液体收集，于 -20℃冻存。