H2DCFDA 别名：DCFH-DA; 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate; 活性氧(ROS)探针
H2DCFDA是一种可渗透细胞，并检测细胞内活性氧 (ROS) 的探针 (Ex/Em=488/525 nm)，可用于细菌活性氧（ROS）产生的测定。
CAS No.：4091-99-0
ACS Nano. 2025 Oct 21;19(41):36813-36825.
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化学性质/溶解性/储存
| 分子量 | 487.29 |
| 分子式 | C24H16Cl2O7 |
| CAS号 | 4091-99-0 |
| 中文名称 | 活性氧(ROS)探针 |
| 溶解性（仅列举部分溶剂） | DMSO: ≥ 90 mg/mL |
| 储存条件 | -20°C, protect from light |
| 运输方式 | 冰袋运输，根据产品的不同，可能会有相应调整。 |
*不同实验中用到的溶剂可能不同，具体实验所需溶剂及溶解方法请参考相关文献描述。
生物活性
H2DCFDA是可渗透细胞，用于检测细胞内活性氧 (ROS) 的探针 (Ex/Em=488/525 nm)。H2DCFDA可以用于细菌活性氧（ROS）产生的测定。
ROS测量
将H2DCFDA溶解在DMSO中以获得10mM储备溶液，并在使用前进一步稀释。
为了检测细胞内ROS水平，使用ROS敏感性探针H2DCFDA。将贴壁细胞（ESC，difESC，eMSC，HeLa，U118）与PBS中的5μM染色溶液在37℃下在黑暗中孵育30分钟，然后用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液收获，悬浮在新鲜培养基中，并且用流式细胞仪立即分析。将对照和PHA活化的淋巴细胞重悬浮于PBS中，与5μM H2DCFDA在黑暗中于37℃温育30分钟，并立即分析。
DCFH-DA 实时追踪烟草叶片 ROS 动态
使用DCFH-DA检测烟草叶片中活性氧的积累水平，特别是验证了转基因烟草（过表达CbRCI35基因）在正常条件和低温胁迫下ROS的动态变化。通过该实验，研究者发现CbRCI35通过调控ROS稳态增强植物的抗寒性。
实验流程
1. 样本处理
a. 取4周龄烟草叶片，切成小圆片（直径约5 mm）。
b. 将叶片圆片浸入含有10 μM DCFH-DA探针的溶液中（避光条件）。
2. 探针孵育
在37°C下避光孵育20分钟，使探针充分穿透细胞膜并被细胞内酯酶水解为DCFH（非荧光形式）。DCFH与ROS（如H₂O₂）反应后生成荧光物质DCF。
3. 洗涤去除多余探针
孵育后，用20 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0） 洗涤叶片3次，彻底去除未进入细胞的探针。
4. 荧光信号检测
a. 使用激光共聚焦显微镜（Zeiss 710） 观察DCF的荧光信号（激发波长488 nm，发射波长525 nm）。
b. 通过荧光强度定量ROS水平，对比野生型与转基因植株的差异。
https://www.frontiersin.org/journals/plant-science/articles/10.3389/fpls.2016.01599/full
实验参考
下述溶液配置方法仅为基于分子量计算出的理论值。不同产品在配置溶液前，需考虑其在不同溶剂中的溶解度限制。
| 浓度/溶剂体积/质量 | 1 mg | 5 mg | 10 mg |
|---|---|---|---|
| 1 mM | 2.0522 mL | 10.2608 mL | 20.5217 mL |
| 5 mM | 0.4104 mL | 2.0522 mL | 4.1043 mL |
| 10 mM | 0.2052 mL | 1.0261 mL | 2.0522 mL |
*吸湿的DMSO对产品的溶解度有显著影响，请使用新开封的DMSO；
请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。
| 细胞系 | Nucleus pulposus cells (NPCs) |
| 方法 | H2DCFDA （Abmole, M9096）was used to detect ROS. After the cell intervention, the suspension cells were digested with pancreatic enzymes. The cells were thoroughly washed with PBS, and a 5 μM H2DCFDA working solution was added and incubated at 37°C for 30 min away from light. The supernatant was centrifuged and washed with PBS for flow cytometry analysis. |
| 浓度 | 5 μM |
| 处理时间 | 30 min |
* 上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献。
建议您制定动物给药及实验方案时，尽量参考已发表的相关实验文献（溶剂种类及配比众多，简单地溶解目的化合物，并不能解决动物给药依从性、体内生物利用度、组织分布等相关问题，未必能保证目的化合物在动物体内充分发挥生物学效用）。
体内实验的工作液，建议您现用现配，当天使用；如在配制过程中出现沉淀、析出现象，可以通过超声和（或）加热的方式助溶。
切勿一次性将产品全部溶解。
请在下面的计算器中，输入您的动物实验相关数据并点击计算，即可得到该实验的总需药量和工作液终浓度。
例如您给药剂量是10 mg/kg，平均每只动物的体重为20 g，每只动物的给药体积是100 μL，动物数量为20只，则该动物实验的总需药量为4 mg，工作液终浓度为2 mg/mL。
1：鉴于实验过程的损耗，建议您至少多配1-2只动物的量；
2：为该产品最终给药时的浓度。
| 动物模型 | |
| 配制 | |
| 剂量 | |
| 给药处理 |
* 上述方法来自公开文献，仅供相同目的实验参考。如实验目的、材料、方法不同，请参考其他文献。
延伸阅读 （仅做信息扩展，不作实验参考）
一、H2DCFDA（DCFH-DA）的机理
H2DCFDA（2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯，AbMole，M9096）是一种常用的活性氧（ROS）荧光探针，广泛应用于细胞生物学、生物化学和分子生物学等领域的研究。H2DCFDA是一种细胞渗透性指示剂，在细胞内的酯酶作用下，其乙酸基团被去除，产物为H2DCF。此时处于非荧光状态，并且无法再通过细胞膜。当细胞内存在氧化环境时，H2DCF会被氧化为发绿色荧光的2,7-二氯二氢荧光素（DCF，EX/EM = 488/525 nm），从而可用于检测细胞内ROS的水平。
图 1. H2DCFDA检测ROS的原理
二、H₂DCFDA（DCFH-DA）的研究应用
H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）作为一种细胞渗透性探针，能够有效检测细胞内的氧化应激和ROS水平。H₂DCFDA可以检测过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O2⁻）、羟基自由基（·OH）和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）等ROS。一般可将细胞与H2DCFDA（多数情况下浓度为10 µM）孵育30分钟，然后用流式细胞术或者荧光显微镜进检测。注意染色过程中要使用无血清的培养基，以免影响检测结果。
近年来，铁死亡（Ferroptosis）研究取得了显著进展，H₂DCFDA作为检测工具在其中发挥了重要作用。通过检测细胞内的ROS水平，并结合ABDP 581/591 C11（AbMoel，M29325）进行脂质过氧化检测，以及CCK-8（AbMole，M4839）等进行细胞活力分析，可以分析细胞死亡的主要原因和类型。2014年，AbMole的两款抑制剂分别被西班牙国家心血管研究中心和美国哥伦比亚大学用于动物体内实验，相关科研成果发表于顶刊 Nature 和 Nature Medicine。
三、范例详解
1. Sci Adv. 2024 Aug 16;10(33):eado7249.
苏州大学第一附属医院的研究人员设计了一种水凝胶（FDA-TA），它可通过重塑铁代谢来修复组织。FDA-TA可以吸附胞外的铁离子，以调节铁代谢并抑制铁死亡，进而促进组织修复。研究者构建了大鼠尾椎穿刺模型，来评估FDA-TA对椎间盘退行性病变（IVDD）的抑制效果。实验人员在探究铁离子（Fe3+）能否引起细胞氧化应激和铁死亡的实验中，使用了AbMole的H₂DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）和JC-1（AbMole，M9724），它们分别被用于检测活性氧（ROS）的生成和线粒体膜电位的变化[1]。
图 2. Fe3+可以诱导细胞氧化应激和线粒体膜电位异常[1]
2. Plant Biotechnol J. 2023 May;21(5):943-960.
兰州大学、宁夏医科大学的研究者们在上述论文中研究了C2H2型锌指转录因子OSIC1在杨树中对渗透胁迫下气孔关闭的正向调控作用。研究发现，OSIC1在盐、干旱、聚乙二醇6000（PEG6000）和脱落酸（M7597，ABA）诱导下表达上调。过表达OSIC1的转基因杨树在上述处理条件下表现出更强的耐受性，这主要是通过减少气孔开度来实现的。而通过CRISPR/Cas9系统产生的OSIC1突变体则表现出相反的表型。此外，OSIC1能够直接上调PalCuAOζ的表达，该基因编码一种含铜多胺氧化酶，可增强保卫细胞（ guard cells，负责储存淀粉调节渗透压的细胞）的过氧化氢积累，从而在环境压力发生时调节气孔关闭。在这项研究中，AbMole的H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用来检测杨树保卫细胞在不同处理条件下的H₂O₂积累情况[2]。
图 3. Detection of H2O2 in guard cells under different treatments[2].
3. Mater Today Bio. 2023 Jun 24;21:100711.
苏州大学第一附属医院的研究者们在上述文章中研发了一种以黑色素为原型的微囊（BHB-PDA-MCs），用于肝纤维化（HF）的抑制。BHB-PDA-MCs的核心为水相，外壳由聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚多巴胺纳米颗粒（PDANPs）组成。PDANPs是天然黑色素的合成类似物，具有抗氧化特性。而微囊的核心用于封装酮体β-羟基丁酸（BHB），这是一种已知的免疫代谢调节剂，能够抑制NLRP3炎症体的激活。在体外实验中，PDANPs能够减轻H2O2诱导的肝细胞（LO2细胞）和肝星状细胞（HSC-T6细胞）的氧化水平，而BHB能够减少巨噬细胞（Raw264.7细胞）产生的促炎和促纤维化因子；在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型中，研究者发现BHB-PDA-MCs能够抑制HSCs的激活，减少ECM蛋白的沉积，减轻肝小叶的损伤，并保护肝功能。在这项研究中，AbMole的H2DCFDA（DCFH-DA，AbMole，M9096）被用来检测LO2和HSC-T6细胞在H2O2刺激下的氧化水平和微囊系统的保护作用。
图 4. Fluorescent images showing the ROS levels in LO2 or HSC-T6 cells after co-cultured with blank control, H2O2, or
or PDA-MCs[3]
参考文献及鸣谢
[1] Y. Xu, F. Cai, Y. Zhou, et al., Magnetically attracting hydrogel reshapes iron metabolism for tissue repair, Science advances 10(33) (2024) eado7249.
[2] Q. Bai, Z. Niu, Q. Chen, et al., The C(2) H(2) -type zinc finger transcription factor OSIC1 positively regulates stomatal closure under osmotic stress in poplar, Plant biotechnology journal 21(5) (2023) 943-960.
[3] X. Zhao, Z. Fan, C. Zhu, et al., Melanin inspired microcapsules delivering immune metabolites for hepatic fibrosis management, Materials today. Bio 21 (2023) 100711.
其他相关的Fluorescent Dye产品
参考文献
[1] Karyne Rangel, et al. Microorganisms. Detrimental Effect of Ozone on Pathogenic Bacteria
以上参考文献由AI整理，仅供参考，AbMole 尚未独立确认这些文献的准确性。
