Calcein Red, AM  别名：钙黄绿素红（红色）

Calcein Red, AM 钙黄绿素红（红色）是用于标记和检测活细胞细胞功能的最流行的荧光探针之一。Calcein Red, AM自身无荧光，具有细胞膜渗透性。一旦进入细胞后，被细胞内酯酶水解为钙黄绿素红（Calcein Red），能与胞内钙离子结合，产生强烈的红色荧光（Ex/Em=560/574），用标准的TRITC/Cy3滤片设置检测。

Calcein Red AM对湿度非常敏感，粉末保存一定要保持干燥。Calcein Red AM储存液需要分装避光冻存，且必须紧紧密封盖子，干燥保存。Calcein Red AM工作液必须现配现用。

使用方法

A、储存液制备

储存液配制范围可为1～5 mM，具体根据工作浓度来决定，建议提前配制成1000×储存液。若使用的工作液为5μM，那么可配制5mM的储存液，即往1mg Calcein Red AM（Mw：1015.79）内加入196μl细胞培养级别的DMSO即可。储存液需要根据单次用量分装，-20℃避光干燥保存，一定要避免受潮，此种情况下可稳定保存数月.

B、20% Pluronic F-127制备

称取100mg Pluronic F-127粉末中加入500μl DMSO，配制成20%(w) DMSO母液。溶解过程需要在40-50℃加热20-30min。溶液室温保存，不用冷藏。如有结晶析出，可以重新加热后溶解，不影响使用。

C、染色步骤

1. 大多数实验体系中Calcein Red AM的工作浓度为2-5μM。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定Calcein Red AM的最佳工作浓度，以最低的探针浓度得到最好的荧光结果为筛选原则。

【注意】：有时可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein Red AM储存液内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管Calcein Red AM储存液内加入等体积的20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。加入Pluronic F127的Calcein Red AM溶液不可长期保存，需现配现用。

2. 对于贴壁细胞，先用胰酶-EDTA消化细胞，离心收集细胞（1000 rpm，3min）。对于悬浮细胞，直接离心收集细胞。

3. 去上清，用PBS（或者其他缓冲液）清洗细胞2~3次，以充分去除残留的酯酶活性。

4. 用1/10细胞培养基体积的Calcein Red AM染色工作液重悬细胞，37℃孵育20min～1h。

【注意】：1）若细胞自身含有机阴离子转运体，需加入丙磺舒（1-2.5mM）或者苯磺唑酮（0.1-0.25mM）到孵育体系内以降低去酯化的Calcein Red泄露到胞外；

2）降低探针加载温度，可能会减少探针区室化现象。

5. 用PBS（或者其他缓冲液）洗涤细胞两次去除多余染料。 【注意】：如有必要，使用含有机阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗；

6. 用含合适滤光片（Ex/Em= 560nm/574nm）的仪器进行检测。