盐酸嘌呤霉素Puromycin dihydrochloride (CL13900 dihydrochloride) 是一种氨基核苷类抗生素,作为蛋白质合成抑制剂。可用于构建肾病模型。
别名:Puromycin 2HCl; CL13900 dihydrochloride
盐酸嘌呤霉素Puromycin dihydrochloride (CL13900 dihydrochloride) 是一种氨基核苷类抗生素,作为蛋白质合成抑制剂。Puromycin有两种抑制作用模式。第一种是作为接受底物,攻击P位点的肽基tRNA,形成新生肽。第二种是通过与氨基酰-tRNA竞争结合到A'位点。
Puromycin对原核和真核生物的翻译过程均有干扰作用。对瞟吟霉素的抗性取决于编码瞟吟霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因。含pac基因的质粒/慢病毒转染/感染细胞后,细胞表达pac基因,因而获得Puromycin抗性,Puromycin即可用于细胞筛选。
使用方法
1、储存液制备
用20mM HEPES (pH7.4)溶液或蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成10 mg/ml的储存液,经0.22 μm滤膜过滤除菌,按照单次用量分装,于-20℃冻存,避免反复冻融。
2、建议工作浓度
对于大多数哺乳动物细胞,Puromycin的工作浓度建议为1~10μg/ml,最佳浓度使用宿主细胞杀灭实验(杀灭曲线)来确定;
在正式实验前,建议先进行Puromycin敏感性检测预实验(确定能在3-5天杀死细胞的最优Puromycin浓度);
细胞转染含pac基因的质粒,或感染含pac基因的慢病毒。24h(转染)或48h(慢病毒感染)后,细胞继续培养于含一定浓度Puromycin的培养基中(注意细胞不要太密,最好细胞密度不超过25%)。
大肠杆菌:LB琼脂培养基筛选敏感转化菌株,使用浓度为100-125μg/ml。
注:使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌阳性转化子不仅需精确的pH值调节,而且受宿主细胞本身状态影响。
3、杀灭曲线的建立
嘌呤霉素合适的筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、代谢情况,以及细胞所处周期等因素有关。为了筛选到稳定表达的细胞株,确定杀死未转染或感染细胞所需的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次实验一定要建立杀灭曲线(kill curve),筛选到适合自身实验体系的最优筛选浓度。
1)于24孔板加入500 μl/孔制备好的细胞悬液,铺足够的孔以保证后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜。理想情况开始抗生素筛选时,细胞达到较高的密度(~60-80%),常用的细胞密度如下:
贴壁细胞:0.8 - 3.0 x 105cells/ml
悬浮细胞:2.5 - 5.0 x 105cells/ml
2)准备筛选培养基:含梯度浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(比如,设置0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/ml,这11个筛选浓度,每个浓度2个复孔);
3)将孵育过夜的细胞清洗后,更换新鲜制备的梯度筛选培养基;之后置于37℃,5%CO2培养箱内孵育;
4)根据细胞的生长状态,约2-3天更换新鲜的筛选培养基;
5)每日监测细胞,观察存活细胞率,从而确定抗生素筛选开始4-6天内有效杀死非转染或者所有非感染细胞的抗生素最低浓度,也就是将用到的最优筛选浓度。
注:如果发现细胞开始变圆但没有从平板表面脱落可能是以下情况,
a)变圆但是未脱落是细胞开始死亡的一个信号,这些需要更长的筛选时间;
b)若在建议浓度1-10μg/ml范围内还不能完全处死细胞,此时需要检测药物是否有效,避免药物的反复冻融(<5)。
注意事项
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
J Ethnopharmacol. 2023 Feb 10;302(Pt A):115897.
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Nucleic Acids Res. 2021 Mar 18;49(5):2848-2858.
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Environ Health Perspect. 2020 Jun;128(6):67008.
Exp Biol Med (Maywood). 2020 Jun;245(11):925-932.
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分子量 | 544.43 |
分子式 | C22H29N7O5.2HCl |
CAS号 | 58-58-2 |
溶解性(25°C) | Water ≥ 30 mg/mL |
储存条件 | -20°C, dry, sealed |
运输方式 | 冰袋运输,根据产品的不同,可能会有相应调整。 |
*下述溶液配置方法仅为基于分子量计算出的理论值。不同产品在配置溶液前,需考虑其在不同溶剂中的溶解度限制。
Concentration / Solvent Volume / Mass | 1 mg | 5 mg | 10 mg |
---|---|---|---|
1 mM | 1.8368 mL | 9.1839 mL | 18.3678 mL |
5 mM | 0.3674 mL | 1.8368 mL | 3.6736 mL |
10 mM | 0.1837 mL | 0.9184 mL | 1.8368 mL |
小鼠 | 大鼠 | 兔 | 豚鼠 | 仓鼠 | 狗 | |
重量 (kg) | 0.02 | 0.15 | 1.8 | 0.4 | 0.08 | 10 |
体表面积 (m2) | 0.007 | 0.025 | 0.15 | 0.05 | 0.02 | 0.5 |
Km 系数 | 3 | 6 | 12 | 8 | 5 | 20 |
动物 A (mg/kg) = 动物 B (mg/kg) × | 动物 B的Km系数 |
动物 A的Km系数 |
例如,依据体表面积折算法,将化合物用于小鼠的剂量20 mg/kg 换算成大鼠的剂量,需要将20 mg/kg 乘以小鼠的Km系数(3),再除以大鼠的Km系数(6),得到化合物用于大鼠的等效剂量为10 mg/kg。
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