pH Fluorescent Probe Red 600, SE  别名：pH荧光探针红600, SE

pH荧光探针红600, SE 是一种pH敏感型荧光染料，其荧光强度随环境pH值变化而显著改变。在酸性条件下（如溶酶体、内吞体或线粒体内膜），荧光信号显著增强；而在中性或碱性环境中，荧光较弱。这一特性使其成为监测细胞内pH动态变化的理想工具。pH荧光探针红600, SE 可用于标记蛋白质和抗体，也可与葡聚糖或乳胶珠结合以研究内吞途径。pH荧光探针红600, SE 在细胞外荧光较弱，但在吞噬体、溶酶体和内体等酸性区室中荧光会大幅增强，从而能够以更低的信号变异性和更高的准确性特异性检测细胞酸性区室，适用于成像或流式应用；同时该染料还可与GFP、Fluo-8、钙黄绿素或FITC标记抗体等绿色荧光染料联用，进行多重细胞功能分析。

细胞实验使用方法（仅供参考）：
在制备荧光探针工作液之前，请根据需要处理细胞。
在DMSO中准备1~10mM荧光探针储备溶液。通过用HEPES-BSA缓冲液(1×,含钙镁)或其他缓冲液将DMSO储备溶液稀释到至成1~10µM的工作液。
将细胞与荧光探针工作液在37℃下孵育15min~2h。
可以用HEPES-BSA缓冲液/或其他缓冲液替换染料加载溶液。
用装有正确滤光片组的合适荧光仪器分析细胞。
储存液的保存：DMSO溶解后可分装成单次用量，-80℃~-20℃保存，6个月内稳定。避免反复冻融。
【注意】
荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

蛋白实验使用方法（仅供参考）：
蛋白储存液（溶液A）
将100 µL反应缓冲液（如1M碳酸钠溶液或pH~9.0的1M磷酸盐缓冲液）与900 µL目标蛋白溶液（如抗体，蛋白浓度建议>2 mg/mL）混合，配制1 mL蛋白标记储存液。
注意事项：
1.蛋白溶液（溶液A）的pH值应为8.5±0.5。若pH低于8.0，需使用1M碳酸氢钠溶液或pH 9.0的1M磷酸盐缓冲液调节至8.0-9.0范围。 
2.蛋白应溶解于1X磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2-7.4）中。若蛋白溶解于Tris或甘氨酸缓冲液，必须用1X PBS（pH 7.2-7.4）透析以去除游离胺类或铵盐（如硫酸铵、醋酸铵等蛋白沉淀常用试剂）。
3.含杂质抗体或用牛血清白蛋白（BSA）、明胶稳定的抗体标记效果不佳。叠氮化钠或硫柳汞可能干扰偶联反应，建议通过透析或离心柱去除以获得最佳标记效果。
4.蛋白浓度低于2 mg/mL会显著降低偶联效率，推荐最终蛋白浓度为2-10 mg/mL。
pH荧光探针红600, SE储存液（溶液B）
向pH荧光探针红600, SE瓶中加入无水DMSO，配制10 mM储存液，通过移液或涡旋混匀。
注意事项：
1.溶液B需在偶联反应前新鲜配制并立即使用。长期储存可能导致染料活性下降。 
2.避光防潮条件下，溶液B可于冷冻保存两周，但需避免反复冻融。
实验操作流程样本
本操作方案仅供pH荧光探针红600, SE偶联反应参考，针对特定蛋白可能需另行优化。
注意： 每种蛋白所需染料/蛋白比例各异，该比例还取决于染料特性。过量标记会损害蛋白结合活性，而标记比例过低则会导致检测灵敏度下降。
进行偶联反应
1.建议以10:1摩尔比（溶液B染料/溶液A蛋白），取95 µL蛋白溶液（溶液A，假设蛋白浓度为10 mg/mL，分子量~200 KD，则蛋白浓度约0.05 mM）加入5 µL染料储存液（溶液B，10 mM），充分振荡混匀
若10:1比例效果不佳，可测试5:1、15:1及20:1等不同比例以确定最佳标记条件。
2.室温下持续旋转或振荡反应混合物30-60分钟。
偶联物纯化
以下为使用Sephadex G-25层析柱纯化的标准流程
1.按制造商说明预处理Sephadex G-25层析柱。
2.将偶联反应液（来自"进行偶联反应"步骤）
3.当样品液面刚好降至柱料顶层下方时，立即加入PBS缓冲液（pH 7.2-7.4），继续加入PBS缓冲液（pH 7.2-7.4）直至目标样品完全洗脱
4.收集含目标染料-蛋白偶联物的组分
保存说明
短期使用：偶联物需用染色缓冲液稀释后分装，避免反复冻融
长期保存：建议浓缩或冻干处理