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ChemBridge全新抗肿瘤化合物筛选--恢复p53，抑制结肠癌

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本研究中使用的无专利限制、多样性强、成药性好、命中率高、活性高、更易优化的类药性化合物库ChemBridge DIVERSet是一种市售的化合物库，由10余万个具有广泛药效团多样性的化合物组成，是目前欧美科学界公认的“最好的多样性化合物库”！国内众多顶级科研机构均已购买。

ChemBridge于1993年成立于美国芝加哥。26年前，在世界范围内第一个推出基于3D药效团设计的多样性化合物库。早在1996年便可提供全产品的质控图谱并完成所有产品的二维码编号。

经过近30年积累，目前已拥有超130万个类药性化合物，超13000个大环类化合物，超14000个化学砌块，累计为全球客户提供了超过3000万个化合物。与Pfizer、Merck、AstraZeneca等国际知名制药企业均有深度合作。

p53是一种关键的肿瘤抑制因子，它在许多人类癌症中发生突变或丢失。p53通路的恢复具有在肿瘤细胞中诱导选择性细胞死亡而不伤害具有完整p53通路的正常细胞的潜力。大多数肿瘤细胞表达突变的p53或通过MDM2的过表达抑制p53。现在很多研究都集中于p53通路。

宾夕法尼亚州立大学赫尔希癌症研究所Colby Richardson教授团队利用ChemBridge化合物库筛选出一种名为CB002的化合物，以及一种与其密切相关的化合物R1，通过评估肿瘤细胞毒性，发现这两种化合物能够在不影响正常细胞的情况下恢复p53途径。突变p53蛋白表达的降低、失活的p53的恢复或p73的某些激活是该药物可能导致肿瘤细胞凋亡和生长停滞的候选机制。

为了筛选出能够恢复p53的小分子，该团队在携带p53-luc报告基因的SW480细胞中使用基于功能细胞的测定法筛选了ChemBridge化合物库中的50000种小分子化合物。发现化合物CB002 (ID为7745998，IPUA名称为8-anilino-1,3dimethyl-3,7-dihydro-1H-purine-2,6-dione) 可增加p53响应性生物发光。同时，还利用结构相似性搜索从ChemBridge总库中发现并鉴定了CB002相关化合物R1 (ID为849102，IPUA名称为8-anilino-1,3,7-trimethyl3,7-dihydro-1H-purine-2,6-dione) (图1A)。与CB002类似，R1在SW480细胞中以剂量依赖性方式增加p53响应性生物发光(图1B和C)。

将CB002和R1进一步应用于由SW480、DLD1、HCT116和HCT116p53null组成的4种结肠直肠癌细胞系。并且如图1所示，CB002增加了SW480 (突变p53R273H、P309S) 和DLD-1 (突变p53 S241F) 细胞中p53响应性生物发光。

Figure1. Screening experimental compounds CB002 and a related compound R1 for transcriptional activation by p53 in cancer cells.

Colby Richardson教授团队对CB002和R1化合物进行的一系列研究表明，CB002部分通过p53突变癌细胞系中的p73激活p53通路信号。但目前尚未确定p73在CB002或R1的抗肿瘤效用中的作用。CB002与传统化疗药物CPT-11和5-FU产生协同作用，导致肿瘤细胞死亡。

CB002部分通过激活表达p53的突变型结直肠癌细胞中的p73来恢复p53通路信号

Figure2. Effect of CB002 and R1 on p53 pathway signaling in cancer cells.

将不同剂量的CB002应用于DLD-1和p73敲低DLD-1细胞。如图2A所示，在用CB002和R1处理的DLD-1细胞中，p21、PUMADR5在8和24小时的蛋白质水平增加。相比之下，在p73敲低DLD-1细胞中，CB002和R1化合物处理的细胞中均不存在p21表达。与对照相比，两种化合物处理的细胞在8小时时PUMA的表达似乎增加。在24小时，观察到化合物R1处理的细胞中PUMA降低，而CB002处理过的细胞与对照相比基本没有变化。DR5在8小时和24小时似乎没有变化，与DLD-1细胞相比，p73敲低DLD-1细胞中的蛋白质水平较低。DLD-1中的p73蛋白水平在8小时似乎没有变化，在24小时与对照相比呈非剂量依赖性适度增加。在p73敲低DLD-1细胞中，两种化合物处理过的细胞在两个时间点均未检测到p73蛋白。这些结果综合起来表明，p73的敲低可能对表达p53的突变癌细胞中的CB002和R1恢复p53通路信号传导有一定影响。

CB002降低结肠直肠癌细胞中的突变p53蛋白水平

Figure3. p53 protein level in cancer cells up on CB002 and R1 treatment.

该团队进一步检查了CB002和R1对癌细胞中突变p53蛋白水平的影响。如图3所示，突变p53蛋白水平似乎随着CB002剂量的增加而显著降低，并随着R1的高剂量而适度降低。相反，在HCT116细胞中，随着CB002和R1剂量的增加，观察到野生型p53的适度增加。

CB002诱导肿瘤细胞死亡，对正常细胞无显著影响

Figure4. CB002 and R1 induce cell death in colorectal cancer cells.

为了验证CB002和R1是否抑制癌细胞生长，研究团队在用CB002和R1处理后，在结直肠癌细胞系SW480、HCT116、HCT116p53¡/¡中测定了细胞活力和亚G1。如图4A-C所示，CB002和R1均以剂量依赖性方式降低SW480、HCT116和HT116p53-null细胞中的细胞活力，其中CB002的作用最大。进行流式细胞术以在处理后72小时评估SW480、HCT116和HCT116 p53-null细胞中的亚G1级分。CB002和R1均以剂量依赖性方式导致SW480、HCT116和HCT116 p53-null细胞中亚G1级分中的细胞比未处理的对照增加。在200mM的剂量下，CB002在SW480和HCT116中导致亚G1级分中的细胞百分比高于R1（图4D）。这些结果表明CB002和R1在结肠直肠癌细胞中诱导细胞死亡。与R1相比，CB002具有更高的抗肿瘤功效。

Figure5. CB002 induces cell death in tumor cells with no significant effect on normal cells.

进一步将CB002应用于人正常成纤维细胞Wi38细胞，发现CB002在Wi38细胞中的IC50远高于结直肠癌细胞、SW480、DLD-1、HCT116和HCT116 p53-null细胞（图5A和B），表明正常细胞和肿瘤细胞之间存在良好的治疗指数。流式细胞术显示以CB002剂量(200mM)处理的正常Wi38细胞中的亚G1部分相对不变，在72小时时有效增加SW480癌细胞中亚G1中20%的细胞（图5C）。

CB002与CPT-11和5-FU协同抑制结直肠癌细胞生长

Figure6. Synergistic effects of CB002 and CPT-11 or 5-FU in treated cancer cells. SW480 cells were treated with CB002 and CPT-11 or 5-FU for 72 hours.

鉴于5-FU和CPT-11是结直肠癌患者的传统化疗药物，常用于联合治疗，研究团队测试了CB002是否可以与CPT-11或5-FU协同诱导结直肠癌细胞死亡。如图6所示，癌细胞的细胞活力随着每种药剂剂量的增加而降低更多，在5-FU中观察到的毒性大于CPT-11（图6A）。与单独的单一药剂处理相比，CB002（66mM）和CPT-11（一系列剂量）的组合处理显著降低了SW480中的细胞活力（图6B）。进一步的组合指数(CI)分析表明CB002和CPT-11的这种组合的协同作用（图6D）。与CB002和CPT-11的联合治疗相似，CB002与5-FU诱导的细胞死亡协同作用。如图6C和E所示，与单独的单一药剂处理相比，CB002（22mM和66mM）与5-FU（60mg/ml）的组合处理显著降低了SW480细胞中的细胞活力。组合指数(CI<1.0)表明CB002和5FU在癌细胞中的协同作用。

总结来讲，靶向p53通路是一种有吸引力的癌症治疗策略。小分子化合物有可能恢复癌细胞中的p53通路信号。本研究正是通过ChemBridge化合物库筛选出了小分子CB002和相关化合物R1，发现这两种化合物能够恢复癌细胞中的p53通路信号。并通过进一步研究证实CB002和R1抑制结肠腺癌细胞生长，对正常细胞Wi38的毒性有限。CB002与传统化疗药物CPT11和5-FU具有协同功效。对癌症治疗的探索更加深入一层。

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